廖英俊，金亞平，林 琳，湯 浩

(1.中國醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，遼寧 沈陽 110001;2.中國醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院勞動衛(wèi)生與職業(yè)病學(xué)教研室，遼寧 沈陽 110001)

近來的研究發(fā)現(xiàn)，氧化損傷也是抗癌藥順鉑(cisplatin)對正常組織的損傷機制之一[1，2]。8-羥基-2-脫氧鳥嘌呤核苷(8-hydroxy-2-deoxyguanosine，8-OHdG)是公認(rèn)的DNA氧化損傷的生物標(biāo)志物[3，4]。本研究中采用免疫組化技術(shù)對注射順鉑后小鼠的腎和腦組織中8-OHdG進行了分析，以檢測順鉑對正常組織細(xì)胞內(nèi)DNA的氧化損傷情況。

1 材料與方法

1.1 動物和分組

ICR系小鼠12只，體重(30±2)g，由中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。實驗期間小鼠自由進食和飲水。觀察一周后，其中6只小鼠作為實驗組，每天腹腔注射3.5 mg/kg bw順鉑，連續(xù)注射5 d;另6只小鼠作為對照組，每天注射等量的生理鹽水。停藥后第3天，經(jīng)心臟用10%福爾馬林灌流固定10min，迅速取腦和腎組織。常規(guī)石蠟包埋切片。

1.2 免疫組織化學(xué)染色

1.2.1 方法 灌流固定后的腦和腎組織經(jīng)常規(guī)乙醇脫水、二甲苯和液體石蠟處理后包埋。4μm連續(xù)切片，封固于多聚賴氨酸玻片。切片按常規(guī)脫蠟和逐級乙醇水化后，蒸餾水中浸泡10min。采用SABC法:H2O2封閉30min，0.1 mol/L PBS洗3次，各5 min，復(fù)合消化液7 min(使DNA變性)，PBS洗3次，各5min。正常兔血清室溫孵育30min，PBS洗3次，各5min，滴加鼠抗羊8-OHdG單克隆抗體(5μg/ml，購自日本防老化研究所)，室溫1 h，PBS洗3次，各5 min，加生物素化兔抗鼠IgG抗體，室溫孵育30min，PBS洗3次，各5min，加堿性磷酸酶底物試劑盒(Histofine SAB-AP，Nichirei，Japan)10min，PBS 洗4次，各5 min，顯色5 min，蘇木素復(fù)染，脫水，透明，中性樹膠封片。另用PBS代替一抗作陰性對照。

1.2.2 結(jié)果的圖像分析 每張切片隨機選取5個高倍視野，用顯微圖像分析儀進行定量分析，測定免疫陽性物質(zhì)積分光密度(integral optical density，IOD)值。IOD值越大表示視野內(nèi)8-OHdG陽性反應(yīng)物的總色度越強，即視野內(nèi)8-OHdG的總量越多。

1.3 統(tǒng)計分析

2 結(jié)果

2.1 8-OHdG在對照組與順鉑給藥組小鼠大腦皮質(zhì)中的表達(dá)

對照組在大腦皮質(zhì)中無免疫反應(yīng)陽性表達(dá)。8-OHdG染色的陽性細(xì)胞位于細(xì)胞核內(nèi)，呈現(xiàn)紅色，胞質(zhì)上未見明顯染色，給藥組在該區(qū)的毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞核上可見大量免疫反應(yīng)陽性表達(dá)物質(zhì)(圖1見彩圖頁Ⅱ)。

2.2 8-OHdG在對照組與順鉑給藥組小鼠海馬區(qū)的表達(dá)

對照組在海馬區(qū)中無免疫反應(yīng)陽性表達(dá)。給藥組在海馬區(qū)的毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞核上可見許多紅色8-OHdG免疫反應(yīng)陽性表達(dá)物質(zhì)(圖2見彩圖頁Ⅱ)。

2.3 8-OHdG在對照組與順鉑給藥組小鼠的腎臟中的表達(dá)

對照組在腎皮質(zhì)中無免疫反應(yīng)陽性表達(dá)。給藥組僅在腎小球的毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞核上可見許多紅色免疫反應(yīng)陽性表達(dá)物質(zhì)(圖3見彩圖頁Ⅱ)。

2.4 腦和腎組織中8-OHdG免疫組化圖像分析

順鉑給藥組小鼠的腦和腎組織中的8-OHdG表達(dá)與對照組比較均顯著增強，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(表1)。

Tab.1 Comparison of the IOD value of 8-OHdG between the brain and kidney of mice(，n=6)

Tab.1 Comparison of the IOD value of 8-OHdG between the brain and kidney of mice(，n=6)

IOD:Integral optical density**P＜0.01 vs control group

Group Cerebral cortex Hippocampus Renal cortex Experimental44.22±12.90**37.50±10.70**33.87±7.63**Control 3.94±1.33 2.93±0.62 6.44±1.62

3 討論

本研究結(jié)果顯示，順鉑可引起大腦皮質(zhì)和海馬的毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞及腎小球毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的DNA氧化損傷。這為研究順鉑的腦組織和腎組織毒作用機制提供了實驗依據(jù)。由于順鉑是通過血液進入機體的各組織，因此，各組織內(nèi)的毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞應(yīng)是順鉑直接作用與損傷的主要細(xì)胞，本研究結(jié)果證實了這一點。腎臟是順鉑毒作用的主要器官。本研究結(jié)果顯示，以3.5 mg/kg bw的劑量連續(xù)5天注射順鉑，只在腎小球的毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞中產(chǎn)生了DNA的氧化損傷，而在腎小管上皮細(xì)胞中未見明顯的氧化損傷。這與我們前期的研究結(jié)果一致[5]。在前期研究中，給予3.5 mg/kg bw順鉑的小鼠腎組織的抗氧化系統(tǒng)出現(xiàn)了氧化應(yīng)激的代償反應(yīng)，腎GSH水平和GSH-Px活性明顯升高，而作為脂質(zhì)氧化損傷檢測指標(biāo)的腎MDA水平?jīng)]有明顯的升高。這可能是腎組織內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的應(yīng)激性代償有效地清除了順鉑誘導(dǎo)產(chǎn)生的自由基，有效地保護了腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)的生物大分子免于氧化損傷。本研究中，對腎組織8-OHdG的檢測結(jié)果符合這一推論。

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[3]Hwang E S，Kim G H.Biomarkers for oxidative stress status of DNA，lipids，and proteins in vitro and in vivo cancer research[J].Toxicol，2007，229(1-2):1-10.

[4]Pilger A，Rǜdiger H W.8-Hydroxy-2'-deoxyguanosine as a marker of oxidative DNA damage related to occupational and environmental exposures[J].Int Arch Occup Environ Health，2006，80(1):1-15.

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