廖英俊，金亞平，林 琳，湯 浩

(1.中國醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院生理學教研室，遼寧 沈陽 110001;2.中國醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院勞動衛(wèi)生與職業(yè)病學教研室，遼寧 沈陽 110001)

近來的研究發(fā)現(xiàn)，氧化損傷也是抗癌藥順鉑(cisplatin)對正常組織的損傷機制之一[1，2]。8-羥基-2-脫氧鳥嘌呤核苷(8-hydroxy-2-deoxyguanosine，8-OHdG)是公認的DNA氧化損傷的生物標志物[3，4]。本研究中采用免疫組化技術對注射順鉑后小鼠的腎和腦組織中8-OHdG進行了分析，以檢測順鉑對正常組織細胞內DNA的氧化損傷情況。

1 材料與方法

1.1 動物和分組

ICR系小鼠12只，體重(30±2)g，由中國醫(yī)科大學實驗動物中心提供。實驗期間小鼠自由進食和飲水。觀察一周后，其中6只小鼠作為實驗組，每天腹腔注射3.5 mg/kg bw順鉑，連續(xù)注射5 d;另6只小鼠作為對照組，每天注射等量的生理鹽水。停藥后第3天，經(jīng)心臟用10%福爾馬林灌流固定10min，迅速取腦和腎組織。常規(guī)石蠟包埋切片。

1.2 免疫組織化學染色

1.2.1 方法 灌流固定后的腦和腎組織經(jīng)常規(guī)乙醇脫水、二甲苯和液體石蠟處理后包埋。4μm連續(xù)切片，封固于多聚賴氨酸玻片。切片按常規(guī)脫蠟和逐級乙醇水化后，蒸餾水中浸泡10min。采用SABC法:H2O2封閉30min，0.1 mol/L PBS洗3次，各5 min，復合消化液7 min(使DNA變性)，PBS洗3次，各5min。正常兔血清室溫孵育30min，PBS洗3次，各5min，滴加鼠抗羊8-OHdG單克隆抗體(5μg/ml，購自日本防老化研究所)，室溫1 h，PBS洗3次，各5 min，加生物素化兔抗鼠IgG抗體，室溫孵育30min，PBS洗3次，各5min，加堿性磷酸酶底物試劑盒(Histofine SAB-AP，Nichirei，Japan)10min，PBS 洗4次，各5 min，顯色5 min，蘇木素復染，脫水，透明，中性樹膠封片。另用PBS代替一抗作陰性對照。

1.2.2 結果的圖像分析 每張切片隨機選取5個高倍視野，用顯微圖像分析儀進行定量分析，測定免疫陽性物質積分光密度(integral optical density，IOD)值。IOD值越大表示視野內8-OHdG陽性反應物的總色度越強，即視野內8-OHdG的總量越多。

1.3 統(tǒng)計分析

2 結果

2.1 8-OHdG在對照組與順鉑給藥組小鼠大腦皮質中的表達

對照組在大腦皮質中無免疫反應陽性表達。8-OHdG染色的陽性細胞位于細胞核內，呈現(xiàn)紅色，胞質上未見明顯染色，給藥組在該區(qū)的毛細血管內皮細胞核上可見大量免疫反應陽性表達物質(圖1見彩圖頁Ⅱ)。

2.2 8-OHdG在對照組與順鉑給藥組小鼠海馬區(qū)的表達

對照組在海馬區(qū)中無免疫反應陽性表達。給藥組在海馬區(qū)的毛細血管內皮細胞核上可見許多紅色8-OHdG免疫反應陽性表達物質(圖2見彩圖頁Ⅱ)。

2.3 8-OHdG在對照組與順鉑給藥組小鼠的腎臟中的表達

對照組在腎皮質中無免疫反應陽性表達。給藥組僅在腎小球的毛細血管內皮細胞核上可見許多紅色免疫反應陽性表達物質(圖3見彩圖頁Ⅱ)。

2.4 腦和腎組織中8-OHdG免疫組化圖像分析

順鉑給藥組小鼠的腦和腎組織中的8-OHdG表達與對照組比較均顯著增強，差異有統(tǒng)計學意義(表1)。

Tab.1 Comparison of the IOD value of 8-OHdG between the brain and kidney of mice(，n=6)

Tab.1 Comparison of the IOD value of 8-OHdG between the brain and kidney of mice(，n=6)

IOD:Integral optical density**P＜0.01 vs control group

Group Cerebral cortex Hippocampus Renal cortex Experimental44.22±12.90**37.50±10.70**33.87±7.63**Control 3.94±1.33 2.93±0.62 6.44±1.62

3 討論

本研究結果顯示，順鉑可引起大腦皮質和海馬的毛細血管內皮細胞及腎小球毛細血管內皮細胞的DNA氧化損傷。這為研究順鉑的腦組織和腎組織毒作用機制提供了實驗依據(jù)。由于順鉑是通過血液進入機體的各組織，因此，各組織內的毛細血管內皮細胞應是順鉑直接作用與損傷的主要細胞，本研究結果證實了這一點。腎臟是順鉑毒作用的主要器官。本研究結果顯示，以3.5 mg/kg bw的劑量連續(xù)5天注射順鉑，只在腎小球的毛細血管內皮細胞中產(chǎn)生了DNA的氧化損傷，而在腎小管上皮細胞中未見明顯的氧化損傷。這與我們前期的研究結果一致[5]。在前期研究中，給予3.5 mg/kg bw順鉑的小鼠腎組織的抗氧化系統(tǒng)出現(xiàn)了氧化應激的代償反應，腎GSH水平和GSH-Px活性明顯升高，而作為脂質氧化損傷檢測指標的腎MDA水平?jīng)]有明顯的升高。這可能是腎組織內抗氧化系統(tǒng)的應激性代償有效地清除了順鉑誘導產(chǎn)生的自由基，有效地保護了腎小管上皮細胞內的生物大分子免于氧化損傷。本研究中，對腎組織8-OHdG的檢測結果符合這一推論。

[1]Rabik C A，Dolan M E.Molecular mechanisms of resistance and toxicity associated with platinating agents[J].Cancer Treat Re v，2007，33(1):9-23.

[2]Rybak L P，Whitworth C A ，Mukherjea D，et al.Mechanismsof cisplatin-inducedototoxicity and prevention[J].Hear Res，2007，226(1-2):157-167.

[3]Hwang E S，Kim G H.Biomarkers for oxidative stress status of DNA，lipids，and proteins in vitro and in vivo cancer research[J].Toxicol，2007，229(1-2):1-10.

[4]Pilger A，Rǜdiger H W.8-Hydroxy-2'-deoxyguanosine as a marker of oxidative DNA damage related to occupational and environmental exposures[J].Int Arch Occup Environ Health，2006，80(1):1-15.

[5]Liao Y J，Tang H ，Jin Y P.Study of toxic effects on hearing，kidney and liver of mice induced by anticancer agent of cisplatin and their mechanisms[J].Chin Pharmacol Bull，2004，20(1):82-85.