武宇洲，崔 煒△，李淑琴，張 雷，魯靜朝

(1.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院，河北省心腦血管病研究所心內(nèi)科;2.病理生理學(xué)教研室;3.組織與胚胎學(xué)教研室，石家莊 050000)

心臟成纖維細胞是心肌纖維化的主要效應(yīng)細胞，也是他汀類調(diào)脂藥物的主要靶細胞。我們以往的研究發(fā)現(xiàn)，普伐他汀可抑制心臟成纖維細胞內(nèi)皮素的合成和分泌[1]，參與抗心肌纖維化過程。近來研究表明，轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-beta 1，TGF-β1)是心肌纖維化發(fā)生、發(fā)展的主要致病因子[2]。普伐他汀是否也調(diào)節(jié)了TGF-β1的合成和分泌，在減輕心臟重塑方面發(fā)揮重要作用，尚不十分清楚。本實驗觀察普伐他汀對醛固酮誘導(dǎo)新生大鼠心臟成纖維細胞TGF-β1 mRNA表達以及TGF-β1合成和分泌的影響。

1 材料與方法

1.1 動物和試劑

出生1～3 d的SD大鼠，購于河北醫(yī)科大學(xué)動物中心。醛固酮、甲羥戊酸、胰蛋白酶、牛血清白蛋白購于美國Sigma公司;DMEM/F12培養(yǎng)基和胎牛血清購于美國Gibco公司;TGF-β1多克隆抗體、纖維連接蛋白多克隆抗體為美國Santa Cruz公司產(chǎn)品。PCR試劑和DNA Marker購于大連TaKaRa公司;TGF-β1 ELISA試劑盒購自上海森雄科技實業(yè)有限公司。普伐他汀由華北制藥集團有限責(zé)任公司提供。

1.2 心臟成纖維細胞的培養(yǎng)和鑒定

取1～3 d齡的SD大鼠，在無菌條件下開胸剪取心室，采用胰酶消化法和差速貼壁分離法獲取和培養(yǎng)心臟成纖維細胞。待心臟成纖維細胞生長接近融合時以1∶3傳代，實驗采用已傳2～4代的心臟成纖維細胞。對心臟成纖維細胞進行形態(tài)學(xué)和SABC法免疫細胞化學(xué)染色鑒定，純度達96%(圖1)。

Fig.1 Fibronectin protein expression in cardiac fibroblasts(×400)

1.3 實驗分組

將心臟成纖維細胞(1×109cells/L)接種于24孔培養(yǎng)板和50ml的玻璃培養(yǎng)瓶中，待細胞生長至亞融合狀態(tài)時，以1%牛血清白蛋白培養(yǎng)液培養(yǎng)預(yù)適應(yīng)24h后，根據(jù)實驗分組要求換用加入各種處理因素的1%牛血清白蛋白培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。實驗分組為6組:(1)正常對照組;(2)醛固酮組(10-7mol/L);(3-5)醛固酮(10-7mol/L)+普伐他汀組(10-5，10-4，10-3mol/L);(6)醛固酮(10-7mol/L)+普伐他汀(10-3mol/L)+甲羥戊酸組(10-2mol/L)。普伐他汀或普伐他汀和甲羥戊酸共同預(yù)處理心臟成纖維細胞24h后，再加入醛固酮作用8 h、24h和48 h后，分別測定心臟成纖維細胞TGF-β1 mRNA的表達、細胞中TGF-β1含量和培養(yǎng)液中TGF-β1水平。

1.4 ELISA法檢測 TGF-β1水平

按照試劑盒說明書操作，測定心臟成纖維細胞培養(yǎng)液中的TGF-β1 水平。

1.5 Western-blot檢測 TGF-β1 含量

裂解細胞后取上清液，進行丙烯酰胺凝膠電泳;水浴式電印跡法將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，室溫下封閉2 h后，加入1∶250的一抗稀釋液，4℃過夜，用TPBS液洗3遍;再加 入1∶6500的HRP標(biāo)記二抗稀釋液，振搖1 h后TPBS液洗3遍;DAB顯色后分析。

1.6 RT-PCR檢測 TGF-β1 mRNA表達

提取細胞總RNA，進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。TGF-β1引物(上游5'-AAT ACG TCA GAC ATT CGG GAA GCA-3'，下游 5'-GTC AAT GTA CAG CTG CCG TAC ACA-3')和GAPDH引物(上游5'-AAT GCA TCC TGC ACC AA-3' ，下游 5'-GTA GCC ATA TTC ATT GTC ATA-3')可擴增出長度為498 bp的TGF-β1 cDNA片段和515 bp的GAPDH cDNA片段。PCR反應(yīng)條件:TGF-β1:94°C變性45 s，48°C退火45 s，72°C延伸90s;GAPDH:94°C 變性45 s，48°C 退火45 s，72°C延伸90s，共進行32個循環(huán)。PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳后分析。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 普伐他汀對醛固酮誘導(dǎo)的心臟成纖維細胞培養(yǎng)液中TGF-β1水平的影響

與正常對照組相比，醛固酮組可促進心臟成纖維細胞培養(yǎng)液中TGF-β1水平。普伐他汀預(yù)處理心臟成纖維細胞24h后，再加入醛固酮作用48 h后，分別測定心臟成纖維細胞培養(yǎng)液中TGF-β1水平。與醛固酮組相比，普伐他汀(10-5，10-4，10-3mol/L)明顯減少心臟成纖維細胞培養(yǎng)液中TGF-β1水平，且呈劑量依賴性(P＞0.05，P＜0.01，P＜0.01)。甲羥戊酸明顯逆轉(zhuǎn)了普伐他汀(10-3mol/L)對醛固酮(10-7mol/L)誘導(dǎo)的心臟成纖維細胞培養(yǎng)液中TGF-β1水平的抑制作用(表1)。

2.2 普伐他汀對醛固酮誘導(dǎo)的心臟成纖維細胞中TGF-β1含量的影響

與正常對照組相比，醛固酮可增加心臟成纖維細胞中TGF-β1含量。普伐他汀預(yù)處理心臟成纖維細胞24h后，再加入醛固酮作用24h后，分別測定心臟成纖維細胞中TGF-β1含量。與醛固酮組相比，普伐他汀(10-5，10-4，10-3mol/L)可劑量依賴性減少心臟成纖維細胞中 TGF-β1含量(P＞0.05，P＜0.01，P＜0.01)。甲羥戊酸完全逆轉(zhuǎn)了普伐他汀(10-3mol/L)對醛固酮誘導(dǎo)的心臟成纖維細胞中TGF-β1含量的抑制作用(表1，圖2)。

Tab.1 Changes of TGF-β1 mRNA ，TGF-β1 synthesis and release()

Tab.1 Changes of TGF-β1 mRNA ，TGF-β1 synthesis and release()

Ald:Aldosterone;Pra:Pravastatin;Mev:Mevalonate*P＜0.01 vs control;#P＜0.01 vs Ald;△P＜0.01 vs Ald+Pra(10-3mol/L)

Group TGF-β1/GAPDH mRNA(n=3)Relative TGF-β1 protein(n=3)TGF-β1(ng/L)(n=6)Control 0.199±0.007 1 56.10±2.69 Ald 0.591±0.049* 2.22±0.28* 104.82±11.18*Ald+Pra(10-5mol/L) 0.505±0.029# 2.00±0.16 95.90±8.30Ald+Pra(10-4mol/L) 0.390±0.021# 1.64±0.14# 83.42±6.28#Ald+Pra(10-3mol/L) 0.214±0.013# 1.11±0.05# 64.65±5.73#Ald+Pra(10-3mol/L)+Mev 0.595±0.054△ 2.22±0.23△ 106.00±11.91△

Fig.2 Western-blot analysis of TGF-β1 expression in cultured cardiac fibroblasts

2.3 普伐他汀對醛固酮誘導(dǎo)的心臟成纖維細胞 TGF-β1 mRNA表達的影響

與正常對照組相比，醛固酮可增加心臟成纖維細胞TGF-β1 mR NA的表達。普伐他汀預(yù)處理心臟成纖維細胞24h后，再加入醛固酮作用8 h后，分別測定心臟成纖維細胞TGF-β1 mRNA的表達。與醛固酮組相比，普伐他汀(10-5，10-4，10-3mol/L)可劑量依賴性減少心臟成纖維細胞TGF-β1 mRNA的表達(P＜0.01)。甲羥戊酸完全逆轉(zhuǎn)了普伐他汀(10-3mol/L)對醛固酮誘導(dǎo)的心臟成纖維細胞TGF-β1 mRNA的表達的抑制作用(表1，圖3)。

Fig.3 RT-PCR analysis of TGF-β1 mRNA expression in cardiac fibroblasts

3 討論

TGF-β1是一類具有激素樣活性的多肽生長因子，是強有力的促心肌纖維化因子，是膠原纖維和其他細胞外成分合成和沉積的強有力的始動因子，可通過跨膜絲氨酸/蘇氨酸激酶的I型II型受體(一種跨膜蛋白的激酶)磷酸化，刺激心臟成纖維細胞大量增生及膠原、纖維粘連蛋白基因的轉(zhuǎn)錄，并能抑制蛋白分解酶對細胞外間質(zhì)的分解作用，從而促進心肌纖維化的形成。研究發(fā)現(xiàn)普伐他汀可改善2型糖尿病大鼠的左室舒張功能，減輕心臟重塑，這一效應(yīng)與其降低心肌中高表達的 TGF-β1有關(guān)[3]。另外，臨床研究顯示辛伐他汀他汀可減輕原發(fā)性高血壓病人心肌纖維化，改善左室舒張功能，并伴有血漿TGF-β1水平下調(diào)[4]。因此，推測他汀類調(diào)脂藥物可能是通過調(diào)節(jié)TGF-β1的過度表達參與抑制心肌纖維化過程的。與這些研究相一致，本實驗結(jié)果顯示，普伐他汀可劑量依賴性抑制醛固酮誘導(dǎo)的心臟成纖維細胞TGF-β1 mRNA表達，以及TGF-β1的合成和釋放，表明普伐他汀減輕心肌纖維化的作用可能是通過其下調(diào)TGF-β1的過度表達介導(dǎo)的。本研究還發(fā)現(xiàn)，普伐他汀抑制醛固酮誘導(dǎo)心臟成纖維細胞 TGF-β1 mRNA表達，以及 TGF-β1合成和釋放的作用可被外源性甲羥戊酸拮抗，進一步支持甲羥戊酸途徑可能參與了普伐他汀的非調(diào)脂作用。這可能與普伐他汀阻斷了甲羥戊酸和這一通路上其他重要的類異戊二烯中間體的生成有關(guān)[5]，從而抑制 Ras和Rho等小分子GTP結(jié)合蛋白的類異戊二烯化修飾，導(dǎo)致胞漿內(nèi)非活性的小分子GTP結(jié)合蛋白堆積，阻斷細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，其所帶來的臨床益處已遠遠超過調(diào)脂作用。

鑒于TGF-β1與心肌纖維化的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，本研究從細胞、分子和mRNA水平觀察到普伐他汀通過甲羥戊酸途徑抑制醛固酮誘導(dǎo)的心臟成纖維細胞TGF-β1 mRNA表達，以及TGF-β1的合成和釋放，為他汀類調(diào)脂藥物的臨床應(yīng)用作用提供了一定的實驗依據(jù)。

[1]武宇洲，崔 煒，李淑琴，等.普伐他汀對醛固酮誘導(dǎo)心臟成纖維細胞內(nèi)皮素合成的影響[J].中國應(yīng)用生理學(xué)雜志，2007，23(3):343-346.

[2]BujakM，F(xiàn)rangogiannis N G.The role of TGF-beta signaling in myocardial infarction and cardiac remodeling[J].Cardiovasc Res，2007，74(2):184-195.

[3]Yu Y，Ohmori K，Chen Y，et al.Effects of pravastatin on progression of glucose intolerance and cardiovascular remodeling in a type II diabetes model[J].J Am Coll Cardiol，2004，44(4):904-913.

[4]張國剛，張賽丹.辛伐他汀對原發(fā)性高血壓心肌纖維化的影響[J].中南大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版)，2005，30(3):280-282.

[5]Haydont V，Bourgier C，PocardM，et al.Pravastatin Inhibits the Rho/CCN2/extracellular matrix cascade in human fibrosis explants and improves radiation-induced intestinal fibrosis in rats[J].Clin Cancer Res，2007，13(18 Pt 1):5331-5340.