崔茂香，陳曉玲△，陳 超，胡曉杰，金 輝

(1.河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所病理生理研究室，2.藥學(xué)院藥理研究室，3.臨床學(xué)院實驗中心，石家莊 050017)

肺纖維化是以細胞外基質(zhì)進行性過度沉積為主要特征的肺間質(zhì)疾病。對于肺纖維化迄今尚無理想的治療方法。肺源性心力衰竭是肺纖維化致死性的并發(fā)癥之一。已公認肺血管結(jié)構(gòu)重塑導(dǎo)致不可逆轉(zhuǎn)的肺動脈高壓，最終引起肺源性心力衰竭。結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor，CTGF)是一種富含半胱氨酸的多肽。離體實驗結(jié)果已顯示，CTGF是導(dǎo)致動脈壁結(jié)構(gòu)重塑的主要細胞因子[1]。我們以往的研究結(jié)果已顯示，在博萊霉素(bleomycin，BLM)誘導(dǎo)的肺纖維化初期，肺動脈壓已明顯升高，并伴有肺動脈壁內(nèi)皮和平滑肌層CTGF上調(diào)，肺動脈壁Ⅰ、Ⅲ型膠原含量增多[2]。因此，有效地阻止肺纖維化所致的肺動脈壁CTGF上調(diào)對于預(yù)防肺源性心力衰竭具有重要意義。羅格列酮(rosiglitiazone，RSG)是過氧化物酶體增殖活化受體γ(peroxisome proliferator-actived receptor-gamma，PPAR-γ)的激動劑。有文獻報道，血管壁有PPAR-γ的表達[3]。還有文獻報道，激活的 PPAR-γ通過阻斷Smad3/Smad4而抑制轉(zhuǎn)化生長因子誘導(dǎo)的人主動脈血管平滑肌細胞CTGF啟動子活性[4]。另有研究發(fā)現(xiàn)，RSG對血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的胸主動脈血管平滑肌細胞CTGF的上調(diào)有抑制作用[5]。RSG對繼發(fā)于肺纖維化的肺動脈壁CTGF的上調(diào)有何影響，迄今尚未見文獻報道。為此，本研究通過觀察PPAR-γ激動劑RSG對BLM誘導(dǎo)的肺纖維化初期大鼠肺動脈壁CTGF上調(diào)、Ⅰ型、Ⅲ型膠原沉積的影響，探討PPAR-γ激動劑RSG對此種類型肺動脈結(jié)構(gòu)重塑的影響及其機制，為PPAR-γ激動劑RSG在預(yù)防肺纖維化并發(fā)癥方面的應(yīng)用提供實驗資料。

1 材料與方法

1.1 材料

清潔級雄性SD大鼠(180～210)g，由河北省實驗動物中心提供。博萊霉素A5系天津太河制藥有限公司產(chǎn)品。天狼星紅(Sigma)。兔抗鼠CTGF第一抗體(Santa Cruz)，生物素化二抗IgG(羊抗兔)和辣根酶標記鏈霉卵白素工作液以及辣根過氧化酶標記的羊抗兔IgG為中杉生物有限公司產(chǎn)品。ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒為Pierce公司產(chǎn)品。JEDA-801D形態(tài)學(xué)圖像分析系統(tǒng)(江蘇捷達科技發(fā)展公司)。偏振光顯微鏡(日本，Olympus)。

1.2 動物模型的復(fù)制、動物分組和實驗設(shè)計

將48只雄性大鼠隨機分為兩部分:一部分大鼠(n=30)用于復(fù)制肺纖維化模型即向大鼠氣管內(nèi)一次性滴入BLM(5 mg/kg bw;另一部分大鼠(n=18)為模型對照即向大鼠氣管內(nèi)一次性滴入與BLM等體積的生理鹽水(normal saline，NS)[2]。將上述大鼠分為四組:BLM+NS組(n=21)、BLM+RSG組(n=9)、NS+NS組(n=9)和NS+RSG 組(n=9)。BLM+NS組和BLM+RSG組是在氣管滴注BLM后第1 d起分別灌胃給予NS(2 ml/d，14 d)或RSG(3mg/(kg?d)，14 d);NS+NS組和NS+RSG組是在氣管滴注NS后第1天起分別灌胃給予NS(2 ml/d，14 d)或RSG(3 mg/(kg?d)，14 d)。各組大鼠分別于氣管滴注后第14天檢測。每組有6只大鼠的肺動脈分別用于免疫組織化學(xué)染色檢測CTGF免疫陽性細胞和苦味酸天狼星紅染色檢測Ⅰ、Ⅲ型膠原;3只大鼠的肺動脈用于CTGF的Western blott分析。此外，BLM+NS組另有12只大鼠的肺動脈被進行體外孵育處理，分為RSG孵育組(DMEM中含RSG 10mmol/L，37℃，5%CO2，24h)和孵育對照組(DMEM培養(yǎng)液 ，37℃，5%CO2，24h)，孵育后經(jīng)常規(guī)固定后行CTGF的免疫組織化學(xué)染色和Ⅰ、Ⅲ型膠原的天狼星紅染色。

1.3 肺動脈壁CTGF蛋白的檢測

1.3.1 免疫組織化學(xué)法檢測肺動脈壁CTGF蛋白含量 用免疫組化染色顯示CTGF免疫陽性細胞。肺動脈壁經(jīng)4%多聚甲醛固定、常規(guī)逐級脫水、透明、石蠟包埋后切片。切片經(jīng)常規(guī)脫蠟至水，3%過氧化氫處理，微波爐內(nèi)修復(fù)，10%羊血清工作液封閉，兔抗 CTGF抗體，4℃過夜，充分沖洗，生物素化二抗IgG(羊抗兔)，37℃孵育30min，沖洗，辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，37℃孵育30min，清洗，DAB顯色，蘇木精復(fù)染。以PBS代替一抗做陰性對照。常規(guī)梯度脫水、透明、中性樹膠封片。每只大鼠取3張肺動脈切片，每張切片隨機選取肺動脈不同部位的5個視野，用圖像分析儀進行圖像分析，測定肺動脈管壁CTGF蛋白的相對含量(用平均光密度以及CTGF陽性面積占結(jié)構(gòu)面積百分比值來表示)。

1.3.2 Western blot檢測肺動脈壁CTGF蛋白含量常規(guī)提取肺組織蛋白?？捡R斯亮藍G250試劑盒測定蛋白濃度。10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠分離蛋白后，用水浴式電轉(zhuǎn)移法將目的蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上。麗春紅S染色，鑒定轉(zhuǎn)膜效果。5%脫脂奶粉封閉后，免疫染色。第一抗體為兔抗大鼠多克隆CTGF抗體(1∶500稀釋);第二抗體為辣根過氧化酶標記的羊抗兔IgG。ECL化學(xué)發(fā)光法檢測。以兔抗大鼠β-actin多克隆抗體為內(nèi)對照。應(yīng)用凝膠圖像分析系統(tǒng)(Gel-Pro Analyzer Version 3.0)進行相對定量，以CTGF蛋白譜帶與β-actin蛋白譜帶積分光密度(Integrated optical density，IOD)的比值表示。

1.4 肺血管壁Ⅰ、Ⅲ型膠原的檢測和觀察

用天狼星紅組化染色顯示Ⅰ、Ⅲ型膠原纖維。肺組織和肺動脈經(jīng)4%多聚甲醛固定、脫水、透明、石蠟包埋后切片。常規(guī)脫蠟至水，0.1%的飽和苦味酸天狼星紅溶液染色，常規(guī)沖洗、乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。在偏振光顯微鏡下Ⅰ型膠原呈桔黃色或黃色;Ⅲ型膠原呈綠色。每只大鼠取3張肺動脈切片，每張切片隨機選取肺動脈不同部位的5個視野，用圖像分析儀，進行圖像分析，測定肺動脈管壁Ⅰ型、Ⅲ型膠原相對含量(用陽性面積占結(jié)構(gòu)總面積百分比值來表示)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 整體水平RSG對模型大鼠肺動脈壁CTGF含量的影響

免疫組織化學(xué)染色顯示:NS+NS組大鼠肺動脈壁各層均有少量CTGF免疫陽性表達的細胞。NS+RSG組大鼠肺動脈壁CTGF表達量與NS+NS組相比，其差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。BLM+NS組大鼠肺動脈壁CTGF表達明顯強于NS+NS組(陽性信號的平均光密度:(0.41±0.02)vs(0.32±0.03)，P＜0.05;陽性面積:8.8%±1.2%vs 1.4%±0.4%，P＜0.01)，提示肺纖維化模型大鼠肺動脈壁CTGF上調(diào)。與BLM+NS組比，BLM+RSG組大鼠肺動脈壁CTGF表達明顯減弱(陽性信號的平均光密度:(0.33±0.04)vs(0.41±0.02)，P＜0.05;陽性面積:1.2%±0.5%vs 8.8%±1.2%，P＜0.01)，并與NS+RSG組之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，提示RSG有阻止BLM模型大鼠肺動脈壁CTGF上調(diào)的作用(圖1見彩圖頁Ⅳ)。

Western blot分析結(jié)果顯示的各組肺動脈壁CTGF含量的變化規(guī)律與免疫組織化學(xué)染色結(jié)果一致(圖2)。

2.2 整體水平RSG對模型大鼠肺動脈壁Ⅰ、Ⅲ型膠原含量的影響

苦味酸天狼星紅染色是顯示I型和III型膠原的特殊染色。在偏振光顯微鏡下可見:NS+NS組和NS+RSG組大鼠肺動脈平滑肌層有少量I型和III型膠原。此兩組大鼠肺動脈壁平滑肌層I型、III型膠原含量及I型/III型膠原比值之間的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，這提示RSG對正常肺動脈壁I型和III型膠原含量無明顯影響。與NS+NS組比，BLM+NS組肺動脈壁I型和III型膠原含量均明顯增多(P＜0.05)，I型/III型膠原比值明顯升高(P＜0.05)，這提示模型大鼠肺動脈壁I型和III型膠原增多，且以I型膠原增多為主。與BLM+NS組相比，BLM+RSG組肺動脈壁 I型、III型膠原含量和I型/III型膠原比值均減低(P＜0.05)，這提示RSG能有效地阻止肺纖維化模型大鼠肺動脈壁膠原的異常沉積(圖3見下頁)。

Fig.2 Changes of content of connective tissue growth factor(CTGF)，detected by Western blot，in pulmonary arteries from various groups(n=3)

2.3 離體水平RSG對模型大鼠肺動脈壁CTGF含量的影響

BLM+NS組大鼠肺動脈經(jīng)RSG(DMEM培養(yǎng)液中含RSG 10μmmol/L)孵育24h后，其肺動脈壁CTGF免疫表達明顯低于單純DMEM培養(yǎng)液孵育的肺動脈壁(平均光密度:0.30±0.01 vs 0.36±0.02，P＞0.05;陽性面積:1.78%±0.26%vs 5.16%±1.14%，P＞0.05)，提示RSG能直接作用于肺動脈壁阻止CTGF的上調(diào)(圖4見彩圖頁Ⅳ)。

2.4 離體水平RSG對模型大鼠肺動脈壁Ⅰ、Ⅲ型膠原含量的影響

BLM+NS組大鼠肺動脈經(jīng)RSG(DMEM培養(yǎng)液中含RSG 10μmmol/L)孵育24h后，其肺動脈壁I型和III型膠原含量(I型膠原染色面積7.4%±0.5%;III型膠原染色面積2.3%±0.3%)與單純DMEM培養(yǎng)液孵育的肺動脈壁(I型膠原染色面積7.7%±1.8%;III型膠原染色面積2.1%±0.4%)之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(圖4見彩圖頁Ⅳ)。

Fig.3 Effects of rosiglitazone(RSG)on the area of typeⅠcollagen and typeⅢcollagen(A)and the ratio of typeⅠcollagen and type Ⅲ collagen(B)，detected by Sirius Red stain，in pulmonary arteries from various groups

3 討論

本研究結(jié)果顯示，PPAR-γ激動劑RSG能有效地阻止BLM誘導(dǎo)的肺纖維化初期大鼠肺動脈壁CTGF的異常增多以及肺動脈壁Ⅰ型、Ⅲ型膠原的沉積。此結(jié)果國內(nèi)外尚未見報道。動脈壁膠原的沉積是動脈壁結(jié)構(gòu)重塑的主要表現(xiàn)之一。因此，本研究結(jié)果預(yù)示，PPAR-γ激動劑RSG在防治肺纖維化初期肺動脈結(jié)構(gòu)重塑方面有很好的應(yīng)用前景。

已公認，動脈壁結(jié)構(gòu)重塑時的膠原沉積主要表現(xiàn)為Ⅰ型和Ⅲ型膠原的增多以及Ⅰ型/Ⅲ型膠原比例的增加。Ⅰ型膠原纖維粗大，與血管壁的抗張性有關(guān);Ⅲ型膠原纖細，與血管壁延伸性有關(guān)。Ⅰ型/Ⅲ型膠原比例的增加，預(yù)示動脈壁順應(yīng)性的降低。動脈壁的這種病理改變使動脈高壓由可逆轉(zhuǎn)向不可逆轉(zhuǎn)的方向發(fā)展。本研究整體水平的結(jié)果顯示，RSG能防止肺纖維化初期肺動脈壁Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原增多以及Ⅰ型/Ⅲ型膠原比值增高。這提示，RSG能通過防止肺纖維化初期肺動脈壁結(jié)構(gòu)重塑，來阻止肺動脈壁僵硬度的增加，進而阻止肺動脈高壓的發(fā)展。

CTGF是一種富含半胱氨酸的多肽。離體實驗結(jié)果已顯示，CTGF促進人胸主動脈平滑肌細胞合成和分泌Ⅰ型和Ⅲ型膠原纖維[6]。PPAR-γ是配體依賴性的核轉(zhuǎn)錄因子。RSG是PPAR-γ的激動劑(配體)。PPAR-γ被RSG激活后與視黃酸X受體形成異二聚體，并與靶基因啟動子上的PPAR反應(yīng)元件結(jié)合，調(diào)節(jié)靶基因的表達。已有文獻報道，激活的PPAR-γ能阻止轉(zhuǎn)化生長因子-β和血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的血管平滑肌細胞CTGF的表達[4，5]。但激活的PPAR-γ對繼發(fā)于肺纖維化的肺動脈平滑肌CTGF上調(diào)的影響，目前國內(nèi)外尚未見報道。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在整體和離體孵育的條件下，RSG都能有效地降低肺動脈壁CTGF的異常增多。雖然RSG阻止模型大鼠肺動脈壁CTGF上調(diào)的機制尚待進一步研究，但本研究結(jié)果足以提示，PPAR-γ的激動劑RSG能直接作用于肺動脈，阻止肺動脈壁CTGF的上調(diào)。由此認為，RSG阻止肺動脈壁CTGF的上調(diào)是其防治肺動脈結(jié)構(gòu)重塑的機制之一。

Crossno JT等學(xué)者[7]的研究發(fā)現(xiàn)，RSG能阻止慢性缺氧大鼠肺動脈壁的增厚，微小動脈肌化以及膠原纖維的沉積。我們以往的研究已驗證，在氣管滴注BLM第14天，大鼠肺內(nèi)主要呈現(xiàn)亞急性或慢性肺泡炎以及肺纖維化初期的病理表現(xiàn)[8，9]。嚴重的肺換氣功能障礙可導(dǎo)致缺氧。本研究在整體水平觀察到的RSG對肺纖維化初期肺動脈壁Ⅰ型、Ⅲ型膠原增多的防治作用，與RSG對上述慢性缺氧大鼠肺動脈壁的作用是一致的。值得一提的是，本研究結(jié)果顯示，在離體孵育條件下RSG對肺動脈壁Ⅰ型、Ⅲ型膠原的異常增多無明顯影響，而RSG能阻止肺動脈壁CTGF的上調(diào)。這提示，RSG可能通過抑制肺動脈壁CTGF的上調(diào)而間接阻止肺動脈壁膠原纖維沉積。上述研究結(jié)果完善了對PPAR-γ在肺纖維化形成初期肺動脈壁結(jié)構(gòu)重塑中作用機制的認識，并為PPAR-γ激動劑RSG在防治繼發(fā)于肺纖維化的肺動脈壁結(jié)構(gòu)重塑方面的應(yīng)用提供實驗證據(jù)。

綜上，PPAR-γ激活劑 RSG能直接作用于肺動脈壁，阻止肺纖維化大鼠肺動脈壁CTGF的上調(diào)，這可能是其減輕動脈壁結(jié)構(gòu)重塑的機制之一。RSG在防治繼發(fā)于肺纖維化的肺動脈結(jié)構(gòu)重塑方面具有較好的臨床應(yīng)用前景。

[1]FanW H，PechM，Karnovsky M J.Connective tissue growth factor(CTGF)stimulates vascular smooth muscle cell growth andmigration in vitro[J].Eur J Cell Biol，2000，79(12):915-923.

[2]崔茂香，陳曉玲，霍春玲，等.結(jié)締組織生長因子在肺纖維化初期肺動脈中的表達[J].生理學(xué)報，2008，60(4):535-540.

[3]Law R E，Goetze S，Xi X P，et al.Expression and function of PPAR-γin rat and human vascular smooth muscle cells[J].Circulation，2000，101(11):1311-1318.

[4]FuM，Zhang J，Zhu X，et al.Peroxisome proliferator-activated receptor gamma inhibits transforming growth factor betainduced connective tissue growth factor expression in human aortic smoothmuscle cells by interfering with Smad3[J].J Biol Chem，2001，276(49):45888-45894.

[5]Gao D F，Niu X L，Hao G H，et al.Rosiglitazone inhibitsangiotensin II-induced CTGF expression in vascular smooth muscle cells-role of PPAR-gamma in vascular fibrosis[J].Biochem Pharmacol，2007，73(2):185-197.

[6]Wang X，LeMaire S A，Chen L，et al.Increased collagen deposition and elevated expression of connective tissue growth factor in human thoracic aortic dissection[J].Circulation，2006，114(1Suppl):I200-205.

[7]Crossno J T Jr，Garat C V，Reusch J E，et al.Rosiglitazone attenuates hypoxia-induced pulmonary arterial remodeling[J].Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2007，292(4):L885-897.

[8]Chen X L，Li W B，Zhou A M，et al.Role of endogenous peroxynitrite in pulmonary injury and fibrosis induced by bleomycin A5 in rats[J].Acta Pharmacol Sin，2003，24(7):697-702.

[9]Chen X L，Huang S S，Li W B，et al.Inhibitory effect of aminoguanidine on bleomycin-induced pulmonary toxicity in rat[J].Acta Pharmacol Sin，2001，22(8):711-715.