高文謙，馬錦玲，韓春光，王 瓊，朱 平，楊庭樹

(1.解放軍總醫(yī)院老年心血管一科，北京 100853;2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所，北京 100850)

慢性心力衰竭是各種心臟疾病的終末階段，已嚴(yán)重影響人們的生活質(zhì)量和壽命，其發(fā)病機(jī)制已成為當(dāng)前的熱點(diǎn)。近年來的研究推測，衰竭的心臟最重要的表現(xiàn)之一就是其β腎上腺素受體(β-adrenegic receptor，βAR)信號(hào)系統(tǒng)受損，導(dǎo)致其對(duì)收縮性刺激敏感性下降。G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptor，GPCR)激酶(kinases，GRKs)是絲/蘇氨酸激酶的一個(gè)家族，對(duì)βARs和GPCRs有脫敏作用[1]。研究提示心衰病人βAR信號(hào)的丟失與心肌G蛋白偶聯(lián)受體激酶2(G protein-coupled receptor kinases 2，GRK2)的表達(dá)和活性增高有關(guān)，被認(rèn)為是心衰病理機(jī)制最常見的一種早期表現(xiàn)，也是心臟功能不全的一種新的早期標(biāo)志[2]。有研究顯示外周血淋巴細(xì)胞能夠表達(dá)GRK2，并且能反映心肌GRK2的表達(dá)狀態(tài)和心肌功能損害的程度[3]，但目前國外此類文獻(xiàn)報(bào)道數(shù)量少，缺少對(duì)高齡老年心衰患者外周血淋巴細(xì)胞GRK2表達(dá)的研究。本文旨在觀察80歲以上高齡老年心衰患者外周血淋巴細(xì)胞GRK2的表達(dá)與心臟射血分?jǐn)?shù)(ejection fraction，EF)的關(guān)系，為高齡心衰患者的病理生理研究及防治提供資料。

1 材料與方法

1.1 對(duì)象與分組

選取近兩年我科收治16位慢性心衰的高齡男性患者，并按患者的心臟EF值將心衰組分為兩個(gè)亞組:心衰A組(A):EF＜45%，共7例(年齡:85±3.2歲)。心衰B組(B):EF≥45%，共9例(年齡:84±2.8歲)。選取8位無心衰老年男性(83±2.6)作為對(duì)照組。

1.2 主要試劑

材料:人淋巴細(xì)胞分離液，天津?yàn)笊镏破房萍加邢挢?zé)任公司產(chǎn)品，Trizol試劑，博邁德生物技術(shù)有限公司;人 β-actin引物:上游 5'-AGC GAG CAT CCC CCA AAG TT-3'，下游 5'-GGG CAC GAA GGC TCA TCA TT-3';人 GRK2引物:5'-GAACACATGCACAATCG-3'，5'-CCAGGGAGAACCAGTC-3'。上述引物均由北京賽百勝公司合成。

1.3 外周血淋巴細(xì)胞分離

采集靜脈血，每份2 ml，EDTA抗凝。將人抗凝靜脈血以PBS稀釋并混勻，再加至裝有淋巴細(xì)胞分離液的離心管中，使三者體積比為1∶1∶1;混合液離心(2000r/min，30min)分層，小心吸出中間淋巴細(xì)胞層，以PBS離心洗滌2次，并計(jì)數(shù)。

1.4 RT-PCR檢測目的基因

取等量的淋巴細(xì)胞離心后，沉淀細(xì)胞再以Trizol試劑按常規(guī)步驟提取總 RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄(45℃30min，99℃5min，5℃5 min)得到cDNA 庫，用于內(nèi)參β-actin和目的基因GRK2的PCR擴(kuò)增。二者的擴(kuò)增條件:94℃30s，55℃30s，72℃45 s，共30個(gè)循環(huán)。所得產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 高齡老年心衰患者的情況

使用美國GE Vivid 7彩色超聲診斷儀，按常規(guī)方法檢測心臟EF值，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果歸納如表1。

Tab.1 EF of heart failure patiants(%，)

Tab.1 EF of heart failure patiants(%，)

EF:Ejection fractionA:EF＜45%;B:EF≥45%*P＜0.05 vs control

Group n EF Control 8 54±2.6 A 740±3.1*B 946±2.2*

2.2 心衰病人外周血淋巴細(xì)胞GRK2 mRNA的表達(dá)

分別從高齡心衰患者和健康老年人外周血分離的淋巴細(xì)胞提取RNA，經(jīng)RT-PCR檢測，顯示心衰患者淋巴細(xì)胞表達(dá)GRK2 mRNA均高于對(duì)照組(P＜0.05);并且心衰A組高于心衰B組(P＜0.05)。圖中顯示，隨著射血分?jǐn)?shù)的減少，外周血淋巴細(xì)胞GRK2 mRNA表達(dá)增加(圖1)。

Fig.1 GRK2 mRNA expression in lymphocytes

3 討論

隨著人們生活水平的提高，心血管疾病的發(fā)病率逐年增高，心衰的發(fā)生率也有明顯增加，高齡老年心衰的死亡率居高不下。采用簡便可靠的方法，能夠及時(shí)了解心衰的發(fā)生、發(fā)展過程，準(zhǔn)確給予相應(yīng)的治療措施，避免心功能進(jìn)一步惡化，延長患者的生命，顯得尤為重要。

大量的研究表明，心肌βAR信號(hào)系統(tǒng)異常是慢性心衰最重要的發(fā)病機(jī)理之一，而βAR信號(hào)系統(tǒng)的異常與心肌GRK2的表達(dá)和活性增高有關(guān)[4，5]。將βARKct基因轉(zhuǎn)入心衰的心肌細(xì)胞，抑制心肌GRK2的表達(dá)，可使衰竭的心臟的βAR信號(hào)系統(tǒng)恢復(fù)正常，心肌收縮功能有明顯改善，心肌的重塑出現(xiàn)逆轉(zhuǎn)[6，7]。所以，檢測心衰患者GRK2的表達(dá)和活性，可以預(yù)測心衰患者心肌功能的發(fā)展程度，也可判斷心衰治療措施的療效。Jonathan等[8]觀察了需要心臟外科手術(shù)治療的心衰晚期患者心肌表達(dá)GRK2表達(dá)的情況，發(fā)現(xiàn)應(yīng)用心臟輔助裝置改善心臟功能后，心肌GRK2的表達(dá)、活性水平均明顯減低，與其外周血淋巴細(xì)胞GRK2的表達(dá)一致。Guido等[3]在臨床研究中也得出了相類似的結(jié)果。說明檢測心衰患者外周血淋巴細(xì)胞GRK2的表達(dá)水平，即可了解患者心肌GRK2的表達(dá)情況，并可重復(fù)檢測，克服了取心肌標(biāo)本難度大、不宜檢測GRK2的困難，對(duì)慢性心衰的研究和防治顯得尤為重要。由于心臟結(jié)構(gòu)的特殊性，很難取得足夠的標(biāo)本，以及患者條件的限制，至今此類臨床研究較少，目前尚未見高齡老年心衰患者的相關(guān)研究。

本文用RT-PCR檢測了高齡老年心衰患者外周血淋巴細(xì)胞GRK2的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)隨著心臟射血分?jǐn)?shù)的減低，淋巴細(xì)胞GRK2mRNA的表達(dá)增加。上文述及，GRK2目前認(rèn)為是反映慢性心衰的重要標(biāo)志之一，但在老年患者，特別是高齡老年患者中的變化規(guī)律報(bào)道并不多見。我們的結(jié)果表明，在高齡老年慢性心衰患者中，越是EF值低的患者，其外周血淋巴細(xì)胞GRK2的表達(dá)水平越高，呈現(xiàn)明顯的負(fù)相關(guān)性。故實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，檢測淋巴細(xì)胞GRK2的表達(dá)可了解高齡老年心衰患者心肌功能病理狀態(tài)，進(jìn)而判斷治療措施對(duì)心衰的療效，為高齡老年心衰的防治研究積累資料。

[1]Tachibana H，Naga Prasad S V，Lefkowitz R J，et al.Level of beta-adrenergic receptor kinase 1 inhibition determines degree of cardiac dysfunction after chronic pressure overload-inducedheart failure[J].Circulation，2005，111(5):591-597.

[2]Cho M C，Rapacciuolo A，Koch W J，et al.Defective betaadrenergic receptor signaling precedes the development of di-lated cardiomyopathy in transgenic mice with calsequestrin overexpression[J].J Biol Chem ，1999，274(32):22251-22256.

[3]Iaccarino G，Barbato E，Cipolletta E，et al.Elevated myocardial and lymphocyte GRK2 expression and activity in human heart failure[J].Eur Heart J，2005，26(17):1752-1758.

[4]Koch W J，Rockman H A，Samama P，et al.Cardiac function in mice overexpressing the beta-adrenergic receptor kinaseor abeta ARK inhibitor[J].Sci，1995，268(5215):1350-1353.

[5]Vinge L E，Raake P W，Koch W J.Gene therapy in heart failure[J].Circ Res，2008，102(12):1458-1470.

[6]Rengo G，Lymperopoulos A，Zincarellic，et al.Myocardial adeno-associated virus serotype 6-beta ARKct gene therapy improves cardiac function and normalizes the neurohormonal axis in chronic heart failure[J].Circulation，2009，119(1):89-98.

[7]Lymperopoulos A，Rengo G，Zincarelli C，et al.Modulation of adrenal catecholamine secretion by in vivo gene transfer and manipulation of G protein-coupled receptor kinase-2 activity[J].Mol Ther，2008，16(2):302-307.

[8]Hata J A，Williams M L，Schroder J N，et al.Lymphocyte levels of GRK2(beta ARK1)mirror changes in the LVAD-supported failing human heart:lower GRK2 associated with improved β-adrenergic signaling after mechanical unloading[J].J Card Fail，2006，12(5):360-368.