張軍峰，姚翠微，劉華鋒，梁 東，陳孝文

(廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腎病研究所，湛江 524001)

腎間質(zhì)纖維化(renal interstitial fibrosis，RIF)是各種慢性腎臟疾病進(jìn)展至終末期腎病的共同途徑，涉及到多方面的機(jī)制[1]。腎小管上皮細(xì)胞(renal tubular epithelial cells，RTECs)向肌成纖維細(xì)胞(myofibroblast，MyoF)轉(zhuǎn)分化(tubular epithelial-myofibroblast transdifferentiation，TEMT)是腎間質(zhì)纖維化的重要機(jī)制之一[2]。腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)分化后，轉(zhuǎn)變成為肌成纖維細(xì)胞，表達(dá)α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(αsmooth muscle actin，α-SMA)，將其分泌到細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)，促進(jìn)腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生。白細(xì)胞介素18(IL-18)是一重要的促炎因子，我們前期研究表明:多種慢性腎臟病(chronic kidney disease，CKD)均有IL-18的表達(dá)和分泌異常，并且腎組織IL-18的表達(dá)量與腎小管-間質(zhì)的損害程度呈正相關(guān)[3-4]，我們還進(jìn)一步在體外實(shí)驗(yàn)中證實(shí)IL-18可促進(jìn)RTECs轉(zhuǎn)分化和凋亡[5]。但I(xiàn)L-18參與腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路尚未明確。p38MAPK是重要的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，本課題旨在探討IL-18是否通過(guò)該細(xì)胞通路介導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

HK-2細(xì)胞株為人近曲腎小管上皮細(xì)胞株(上海交通大學(xué)附屬瑞金醫(yī)院陳楠教授饋贈(zèng))。細(xì)胞在含10%FBS 、0.03%L-Glutamine、100U/ml青霉素和 100μg/ml鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)，細(xì)胞按 1×105cells/ml的密度均勻接種至六孔板。培養(yǎng)24h至亞融合狀態(tài)時(shí)用無(wú)血清DMEM/F12培養(yǎng)基同步細(xì)胞 24h ，加入含不同濃度(0μmol/L 、5μmol/L 、10μmol/L 、20μmol/L)的 SB203580(Calbiochem ，德國(guó))預(yù)孵育30min，除空白對(duì)照組外，其余各組再加入終濃度為100ng/ml的人重組IL-18(MBL，日本)，繼續(xù)培養(yǎng)24h、48 h、72 h，按期收集細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2 ELISA方法檢測(cè)培養(yǎng)HK-2細(xì)胞上清α-SMA水平

PBS 洗滌細(xì)胞，吸干PBS，每孔加入120μl細(xì)胞裂解液(含0.1 mg/ml PMSF和0.1%aprotinin)，充分混勻后置4℃裂解過(guò)夜，次晨4℃、12000r/min離心10min獲取上清液，-70℃保存?zhèn)溆?。采用?xì)胞酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)細(xì)胞裂解后上清α-SMA蛋白質(zhì)水平，人α-SMA ELISA試劑盒購(gòu)自BPB(U.S.A)，靈敏度為0.1 ng/ml，檢測(cè)過(guò)程嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書操作，所有的標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品做雙孔，α-SMA水平以pg/mg蛋白表示。

1.3 RT-PCR方法檢測(cè)HK-2細(xì)胞α-SMA mRNA表達(dá)

收集細(xì)胞后，PBS洗滌細(xì)胞，用TRIzol(Invitrogen，U.S.A)抽提細(xì)胞總RNA，繼之應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Invitrogen，U.S.A)進(jìn)行 cDNA第一鏈的合成;PCR擴(kuò)增條件、引物及產(chǎn)物見(jiàn)表1。PCR產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠電泳中分離，凝膠成像系統(tǒng)成像，圖象分析處理系統(tǒng)進(jìn)行灰度掃描、拍照、分析電泳帶積分光密度。

Tab.1 Primer array and condition of PCR amplification

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果

2.1 SB203580對(duì)HK-2細(xì)胞α-SMA mRNA表達(dá)的影響

IL-18可顯著提高HK-2細(xì)胞α-SMA mRNA的表達(dá)，SB203580對(duì)IL-18誘導(dǎo)的α-SMA mRNA表達(dá)具有顯著的抑制作用，并呈一定的劑量依賴趨勢(shì)(圖1，表2)。

Fig.1 Effect of SB203580onα-SMA mRNA expression of HK-2 cells

Tab.2 Effect of SB203580on α-SMA mRNA expression of HK-2 cells(，n=3)

Tab.2 Effect of SB203580on α-SMA mRNA expression of HK-2 cells(，n=3)

*P＜0.01 vs control;#P＜0.05，##P＜0.01 vs IL-18

Group α-SMA mRNA/β-actin mRNA 24h 48 h 72 h Control 0.189±0.019 0.209±0.021 0.308±0.018 IL-18 group 0.436±0.045* 0.633±0.052* 0.716±0.039*IL-18+5 ng/ml SB203580 0.336±0.036# 0.522±0.035# 0.678±0.081 IL-18+10ng/ml SB203580 0.263±0.026## 0.501±0.029## 0.595±0.034 IL-18+20ng/ml SB203580 0.236±0.036## 0.420±0.024## 0.560±0.056#

2.2 SB203580對(duì)HK-2細(xì)胞α-SMA表達(dá)的影響

IL-18可顯著提高HK-2細(xì)胞表達(dá)α-SMA蛋白質(zhì)，SB203580對(duì)IL-18誘導(dǎo)的α-SMA蛋白質(zhì)表達(dá)具有顯著的抑制作用，并呈一定的劑量依賴趨勢(shì)(表3)。

Tab.3 Effect of SB203580on α-SMA protein expression of HK-2 cells(，n=3)

Tab.3 Effect of SB203580on α-SMA protein expression of HK-2 cells(，n=3)

**P＜0.01 vs control;##P＜0.01 vs IL-183

Group α-SMA/total protein(pg/mg)24h 48 h 72 h Control 0.926±0.022 0.949±0.012 0.979±0.014 IL-18 group 1.500±0.018** 1.658±0.031** 1.779±0.023**IL-18+5 ng/ml SB203580 1.354±0.024## 1.610±0.022 1.757±0.016 IL-18+10ng/ml SB203580 1.265±0.016## 1.553±0.014## 1.721±0.020##IL-18+20ng/ml SB203580 1.218±0.025## 1.480±0.026## 1.683±0.018##

3 討論

IL-18是一種主要由單核/巨噬細(xì)胞分泌的炎癥因子。我們與國(guó)內(nèi)外同行的研究均已證實(shí)IL-18參與急、慢性腎損傷過(guò)程[3-4，6-7]。IL-18參與腎損害的機(jī)制之一是促進(jìn)RTECs轉(zhuǎn)分化和凋亡，從而參與CKD的腎小管-間質(zhì)纖維化發(fā)生發(fā)展過(guò)程。近年來(lái)，關(guān)于上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制研究受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注，王玉等[8]發(fā)現(xiàn)IL-1β刺激腎小球系膜細(xì)胞表達(dá)α-SMA表達(dá)由p38MAPK途徑介導(dǎo);張梅等[9]報(bào)道抑制p38MAPK通路可下調(diào)血小板衍生生長(zhǎng)因子(platelet-derived growth factor，PDGF)所誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞α-SMA的表達(dá)。Zhang等[10]研究發(fā)現(xiàn)IL-1β可通過(guò)激活c-Jun氨基端激酶(C-Jun N-terminal kinase，JNK)和p38MAPK信號(hào)途徑介導(dǎo)HK-2細(xì)胞轉(zhuǎn)分化。IL-18是否通過(guò)p38MAPK通路介導(dǎo)RTECs轉(zhuǎn)分化，目前國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)資料報(bào)道。

為此我們首先觀察了IL-18對(duì)HK-2細(xì)胞α-SMA表達(dá)的影響，結(jié)果表明IL-18呈時(shí)間依賴性地明顯上調(diào)α-SMA的表達(dá)，細(xì)胞形態(tài)也由正常的鋪路石樣變?yōu)樗笮?，表明部分HK-2細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為MyoF，此結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了IL-18可促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化[5]。接著我們應(yīng)用 p38MAPK特異性阻斷劑SB203580阻斷p38MAPK的活性，觀察其對(duì)IL-18上調(diào)HK-2細(xì)胞表達(dá)α-SMA的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，予SB203580預(yù)孵育HK-2細(xì)胞后，IL-18所誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞α-SMA的基因轉(zhuǎn)錄和蛋白合成均受抑制，其抑制作用與抑制劑SB203580的濃度呈一定程度劑量依賴關(guān)系。Zhang[10]等發(fā)現(xiàn)p38MAPK信號(hào)通路也是介導(dǎo)IL-1β所誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的通路，即IL-18和IL-1促RTECs轉(zhuǎn)分化可能通過(guò)相同通路，因此，抑制p38MAPK信號(hào)通路可能同時(shí)阻斷IL-18和IL-1兩種有害炎癥因子的作用，p38MAPK通路能否作為減輕CKD患者腎小管-間質(zhì)損傷治療的新靶點(diǎn)值得進(jìn)一步研究。

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