趙 瑛，鄔麗莎，楊 燁

(1.瀘州醫(yī)學(xué)院生理教研室，2.瀘州醫(yī)學(xué)院生化教研室，四川 瀘州 646000;3.成都中醫(yī)藥大學(xué)眼科實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610075)

藥物成癮是一種以失去行為控制和強(qiáng)迫性連續(xù)用藥為主要特征的慢性復(fù)發(fā)性腦疾病。機(jī)體脫癮后有95%以上復(fù)發(fā)率，這是臨床上難以根治成癮的原因所在。研究發(fā)現(xiàn)，慢性給予可卡因的大鼠長期戒斷后，一種非依賴受體活化的G蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)激活因子3(activators of G protein signaling 3，AGS3)的含量在大腦前額葉皮質(zhì)(prefrontal cortex，PFC)和伏隔核(nucleus accumbens，NAc)中顯著升高[1]。用AGS3的反義寡核苷酸抑制AGS3的表達(dá)后，大鼠對(duì)藥物的渴求行為消失[2]。所以推測(cè)，大腦內(nèi)的AGS3可能在藥物渴求和復(fù)吸等方面起著重要的作用。但是目前對(duì)于AGS3起作用的機(jī)制還不明確。

目前對(duì)于成癮的研究主要集中于腦獎(jiǎng)賞系統(tǒng)—中腦邊緣多巴胺系統(tǒng)，大腦前額葉皮質(zhì)是該系統(tǒng)的一個(gè)組成部分，它參與了藥物成癮相關(guān)的行為、情緒變化的調(diào)節(jié)和控制，而行為和情緒的改變直接受皮質(zhì)興奮性改變的影響[3]。目前雖然對(duì)NAc區(qū)的離子通道有所研究，但對(duì)成癮機(jī)體與大腦皮質(zhì)興奮性改變有關(guān)的離子通道研究甚少，而瞬時(shí)外向鉀電流IA(transient outward K+current)又與興奮性密切相關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)，觀察嗎啡慢性處理對(duì)大鼠前額葉皮質(zhì)神經(jīng)元瞬時(shí)外向鉀電流的影響，并用信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)蛋白AGS3的抗體阻斷AGS3的作用，觀察其對(duì)瞬時(shí)外向鉀電流的影響，從而進(jìn)一步探索AGS3蛋白在嗎啡成癮中的作用機(jī)制，為更好地研究控制成癮的藥物提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和試劑

SD乳鼠，雌雄不拘，由瀘州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

鹽酸嗎啡注射液(沈陽第一制藥廠制造，批號(hào)061202，10mg/ml)，4-AP 、TEA 、EGTA 、ATP-Mg、GTP 、phosphocreatin，胰蛋白酶(均購于Sigma)，HEPES(購于 Amresco)，DMEM/F12(Dulbecco'S Modified Eagle Medium:Nutrient Mixture F-12(Ham)1∶1，Gibcol)，B-27(B-27 serum-free supplements，Gibco1)(購于 GIBCO)，AGS3(R-20)antibody(購自 Santa Cruz公司)，小牛血清購自(蘭州民海生物)，阿糖胞苷(購自上海華聯(lián)制藥有限公司)，其余藥品均為國產(chǎn)分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)方法 采用乳鼠大腦皮層神經(jīng)元原代培養(yǎng)方法[4]。取出生24h內(nèi)的SD大鼠，75%酒精消毒，在無菌條件下分離大鼠腦組織，置于預(yù)冷的解剖液中，在解剖鏡下用眼科無齒鑷小心分離并剔除血管等結(jié)締組織，清洗分離出大腦前額皮層組織，用吸管把皮層組織移入離心管中，加入終濃度0.025%的胰酶5 ml，用吸管吹打腦組織至無明顯組織塊，靜置5 min，取上清液入預(yù)置有5 ml DMEM 培養(yǎng)基的離心管中，終止消化，離心，1200r/min，8 min。棄上清，加入DMEM培養(yǎng)基5 ml，吹打混勻，離心，1200r/min，8 min。棄上清 ，加入含10%牛血清DMEM培養(yǎng)基5 ml吹打混勻，接種于24孔板中，置于37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，24h后將培養(yǎng)基換成無血清培養(yǎng)基，以后隔3 d換液1次。細(xì)胞培養(yǎng)5 d后可用于膜片鉗記錄。

1.2.2 嗎啡慢性處理細(xì)胞的方法 根據(jù)Liu等[5]的方法，用10μmol/L嗎啡處理大鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)元，48 h后用于膜片鉗實(shí)驗(yàn)。

1.3 AGS3抗體對(duì)嗎啡慢性處理細(xì)胞的作用方法

在大腦中AGS3蛋白主要在神經(jīng)元中表達(dá)，免疫印跡和共聚焦成像顯示，95%的AGS3主要分布于細(xì)胞質(zhì)中[6]，為了使AGS3抗體與AGS3蛋白充分的結(jié)合，在我們的實(shí)驗(yàn)中，用電極液配置AGS3抗體成 10-3μg/L、10-2μg/L、10-1μg/L 三種不同濃度，AGS3抗體通過電極液導(dǎo)入細(xì)胞，使抗體與AGS3蛋白特異結(jié)合，作用時(shí)間2 h，記錄IA。

1.4 記錄電極及電極液

記錄電極選硬質(zhì)玻璃微電極，經(jīng)微電極拉制儀(P-97 SUTTER INSTRUMENT CO.USA)兩次拉制，拉成尖端為 1～2μm，電極內(nèi)液阻抗為2～5 MΩ的玻璃微電極，用于全細(xì)胞電流記錄。實(shí)驗(yàn)中電極液成分(mmol/L):KOH 110，KCl 20，Asp 110，MgCl21，HEPES 10，EGTA 5 ，ATP-Mg 5 ，GTP 0.1 ，phosphocreatin 5，以KOH調(diào)節(jié)pH值7.2。細(xì)胞浴液成分(mmol/L):NaCl 136 ，KCl 5.4 ，CaCl21.0，MgCl21.0，NaH2PO40.33，HEPES 5，Glucose 10，CoCl23，以 NaOH 調(diào)節(jié) pH值7.35。

1.5 全細(xì)胞膜片鉗實(shí)驗(yàn)記錄

在室溫條件下(20～25℃)，利用Axopatch200B Axon膜片鉗放大器進(jìn)行全細(xì)胞記錄，采樣頻率為10kHz，低通濾波頻率為2 kHz。瞬時(shí)外向鉀電流(IA)是一去極化激活的外向電流，刺激方案為:保持電位(-65 mV)，從-55 mV 去極化至+65 mV，階躍 10mV，刺激頻率0.5 Hz。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

本實(shí)驗(yàn)采用不同處理組細(xì)胞組間對(duì)比觀察，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，采用SPSS10.0軟件作兩組之間t檢驗(yàn)及方差分析。

2 結(jié)果

2.1 培養(yǎng)的SD乳大鼠皮層神經(jīng)元IA的特性

在實(shí)驗(yàn)中記錄到一快速激活與失活的外向電流，且呈電壓依賴性，該電流可被2 mmol/L 4-AP抑制，而對(duì)TEA不敏感，即該電流為IA(圖1)。

Fig.1 Identification of IA

2.2 嗎啡對(duì)SD乳大鼠皮層神經(jīng)元IA的影響

實(shí)驗(yàn)中嗎啡的終濃度是 10μmol/L，處理 48 h。用全細(xì)胞膜片鉗方式記錄嗎啡慢性處理組神經(jīng)元IA的變化，嗎啡能使大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元電流明顯升高(圖2)。

Fig.2 Comparison of current density between the control and morphine group(，n=8)

2.3 AGS3抗體能抑制嗎啡引起的IA升高，而對(duì)對(duì)照組無影響

當(dāng)膜電位是+55 mV時(shí)，不同濃度的AGS3抗體作用于10μmol/L嗎啡處理48 h后的細(xì)胞引起電流密度發(fā)生改變，10-3μg/L抗體對(duì)IA有抑制作用，但與嗎啡處理組相比無顯著的差異(P＞0.05)，10-2μg/L和10-1μg/L的抗體對(duì)電流密度的抑制均有顯著性(P＜0.01)，但此兩組之間效應(yīng)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。同等效應(yīng)時(shí)取濃度較小者，故觀察抗體對(duì)電流的效應(yīng)時(shí)，抗體的濃度固定于10-2μg/L(表1，圖 3)

Fig.3 Effect of AGS3 antibody 10-2μg/L on the current density of the control group and the morphine group at the membrane potential of+55 mV

Tab.1 Effect of AGS3 antibody on the current density of morphine group(，n=8)

Tab.1 Effect of AGS3 antibody on the current density of morphine group(，n=8)

**P＜0.01 vs current density of morphine group

Group(μg/L)Current density(pA/pF)Before using Anti-AGS3 After using Anti-AGS3 Change(%)10-3 64.52±15.50 62.76±9.96 -2.7210-2 67.44±18.25 41.61±12.70** -38.3010-1 63.28±15.94 35.06±5.67** -44.60

3 討論

鉀通道是一類存在于生物膜上對(duì)鉀離子具有一定選擇性通透能力的蛋白復(fù)合物，種類多、功能復(fù)雜，是所有真核生物細(xì)胞維持正常生理功能所必須的一大類跨膜蛋白。它能控制細(xì)胞膜內(nèi)外鉀離子的動(dòng)態(tài)平衡，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞膜電位而參與一系列生理和病理過程。神經(jīng)元上鉀通道的變化可引起膜興奮性的改變。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，慢性嗎啡處理能增強(qiáng)前額葉皮質(zhì)神經(jīng)元IA，這一研究結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道的嗎啡慢性處理增強(qiáng)新生大鼠尾核神經(jīng)元電壓門控性鉀電流的研究相似，而在本研究中，該作用又被AGS3抗體所阻斷，推測(cè)AGS3參與IA相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。

Yao等研究指出，μ阿片受體的活化與藥物渴求和復(fù)發(fā)相關(guān)，這可能與μ阿片受體的活化能使cAMP/PKA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)上調(diào)有關(guān)。在PFC和NAc中，μ阿片受體活化引起的PKA信號(hào)傳遞上調(diào)需要AGS3的參與，其作用機(jī)制可能是:一方面，AGS3與Gαi3結(jié)合，使βγ亞基激活下游的效應(yīng)器ACⅡ和ACⅣ，進(jìn)而使cAMP/PKA信號(hào)通路上調(diào)[7，8]，而該通路的活化是藥物耐受依賴的細(xì)胞內(nèi)機(jī)制。另一方面，在長期的可卡因處理后，大腦中AGS3蛋白水平持續(xù)升高，AGS3與Gi結(jié)合，由此可引起多巴胺D2/Gi調(diào)節(jié)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路下調(diào)，同時(shí)加強(qiáng)多巴胺D1/Gs調(diào)節(jié)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[2]，也使細(xì)胞活性、AC、cAMP、PKA和下游的效應(yīng)器(如CREB、Fos相關(guān)蛋白)的水平顯著升高。這兩條途徑都使PKA的水平升高，誘導(dǎo)了鉀通道的磷酸化而增加了IA通道的開放概率[9]。此外Gαi水平的下調(diào)，降低了對(duì)鉀通道的抑制作用，激活K+通道，使神經(jīng)元鉀離子電流增加。

IA通道開放的增加，防止動(dòng)作電位在樹突的傳播，降低神經(jīng)元胞體和樹突膜的興奮性。興奮性降低與全身乏力，始動(dòng)性不足，懶惰，欣快感缺乏，情感反應(yīng)淡漠，沮喪等精神行為改變有關(guān)。

在我們的實(shí)驗(yàn)中，AGS3抗體作用于嗎啡處理的神經(jīng)元，能抑制嗎啡引起的IA升高，且呈劑量依賴性，而對(duì)對(duì)照組神經(jīng)元鉀電流無顯著影響，推測(cè)其機(jī)制可能是AGS3抗體與AGS3蛋白特異性結(jié)合，阻斷了AGS3蛋白在嗎啡慢性處理中所引起的上述作用，使上調(diào)的cAMP/PKA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路恢復(fù)，減少了對(duì)鉀通道的磷酸化而使IA的開放減少，而對(duì)對(duì)照組無影響是由于正常機(jī)體中AGS3的含量不足以引機(jī)體的反應(yīng)。因此，AGS3蛋白在阿片類物質(zhì)成癮中的作用可能是通過與IA信號(hào)傳遞通路起作用，但仍然需要對(duì)該通路進(jìn)行進(jìn)一步的探討。

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