張 偉，王燕凌，王惠娟，苗智慧，夏曉紅2，△

(1.華北煤炭醫(yī)學(xué)院生理教研室，河北 唐山 063000;2.河北醫(yī)科大學(xué)生理教研室，石家莊 050017;3.河北省醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)研究所，石家莊 050021)

腎臟缺血/再灌注損傷(renal ischemia/reperfusion injury，RI/RI)是缺血性急性腎功能衰竭的重要環(huán)節(jié)，而后者是臨床常見急危重癥，預(yù)后險惡，死亡率高。以往的研究表明，腎臟缺血再灌注損傷的發(fā)病機制與氧自由基(oxygen free radical，OFR)所致的脂質(zhì)過氧化損傷密切相關(guān)。目前研究認為，活性氧的蓄積容易引起氧化損傷，這與老年腎臟疾病及衰老過程密切相關(guān)。而機體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)在阻止活性氧(reactive oxygen species，ROS)的氧化損傷作用時起著關(guān)鍵性的作用。本實驗以青年和老年大鼠作為主要研究對象，探討氧化和抗氧化防御系統(tǒng)失衡以及熱休克蛋白70(heat shock protein，HSP70)、一氧化氮(nitrc oxide，NO)、誘生型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)在腎損傷中的作用，為預(yù)防老年腎臟疾病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物分組

雄性SD大鼠36只(由河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供)，分為青年鼠組(10周齡，體重200～300g)18只，老年鼠組(20月齡，體重500～650g)18只。每組又隨機分為假手術(shù)組(YC和AC組)、缺血/再灌注組(YI/R和AI/R組)、缺血/再灌注+維生素E組(YI/R+VE和AI/R+VE組)。

1.2 藥品與儀器

血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)、血肌酐(serum creatinine，Scr)試劑盒購自北京北化康泰臨床試劑有限公司，丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、NO試劑盒購于南京建成生物工程研究所，HSP70抗體購自Santa Cruz公司，iNOS試劑盒購自上海滬尚生物科技有限公司，Epics-XLⅡ型流式細胞儀(Beckman Coulter)等。

1.3 腎臟缺血/再灌注損傷模型制作

將SD大鼠用3%的戊巴比妥鈉溶液(100mg/kg)腹腔麻醉，開腹，暴露雙側(cè)腎動、靜脈。采用夾閉雙側(cè)腎動、靜脈45 min后恢復(fù)血流的方法，復(fù)制腎缺血/再灌注損傷模型。再灌后逐層縫合腹膜，腹壁肌肉和皮膚。假手術(shù)組除不夾閉雙側(cè)腎動、靜脈外，余手術(shù)操作同實驗組。給藥組于手術(shù)前灌胃給藥飼養(yǎng)一個月，VE的給藥劑量為24h 500mg/kg，再灌注后24h取腹主動脈血和腎皮質(zhì)組織，待測各規(guī)定指標。

1.4 測定指標

1.4.1 血清MDA含量測定 采用硫代巴比妥法。過氧化脂質(zhì)降解產(chǎn)物中的丙二醛可與硫代巴比妥酸縮合，形成紅色降解產(chǎn)物，在532 nm處有最大吸收峰。結(jié)果以nmol/ml表示。嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.4.2 血清SOD含量測定 通過黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶反應(yīng)體系產(chǎn)生超氧陰離子自由基(O2-)，后經(jīng)氧化羥胺形成亞硝酸鹽，在顯色劑的作用下呈現(xiàn)紫藍色，用可見分光光度計測量其吸光度。酶的活力單位:每毫升反應(yīng)液中SOD抑制率達50%時所對應(yīng)的SOD量為一個活力單位(U)。結(jié)果以U/ml表示。嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.4.3 血清BUN含量測定 采用OPA法。在酸性環(huán)境中，尿素在催化劑的作用下，可與顯色劑反應(yīng)，生成藍色化合物，其顏色的深淺與尿素含量成正比。結(jié)果以mg/L表示。嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.4.4 血清Scr含量測定 采用苦味酸不除蛋白法。應(yīng)用血清肌酐測定試劑盒檢測再灌后24h血清中肌酐含量，結(jié)果以mg/L表示。嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.4.5 血清NO含量測定 采用硝酸還原酶法。NO化學(xué)性質(zhì)活潑，在體內(nèi)代謝會很快轉(zhuǎn)變成和，而又進一步轉(zhuǎn)化成，本法應(yīng)用硝酸還原酶特異性將還原為，通過顯色深淺測定其濃度的高低。應(yīng)用血清NO測定試劑盒檢測再灌后24h血清中NO含量，結(jié)果以μmol/L表示。嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.4.6 血清iNOS含量測定 采用雙抗體夾心酶標免疫分析法測定標本中iNOS水平。用純化的抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入iNOS抗原、生物素化的抗大鼠iNOS抗體、HRP標記的親和素，經(jīng)過徹底洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的iNOS呈正相關(guān)。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度(A值)，計算樣品濃度。

1.5 組織標本的處理

1.5.1 腎皮質(zhì)細胞凋亡率 將70%乙醇固定的腎皮質(zhì)組織在120目不銹鋼網(wǎng)上剪、搓碎，300目銅網(wǎng)過濾制備為單細胞懸液，懸液濃度為1×108cells/L，取懸液0.1 ml加入10%雞紅細胞作為內(nèi)參標準，與樣品同步染色，加入碘化丙啶(PI)(PI:50mg/L，triton-x 1001.0%)1 ml，4℃冰箱染色 30min，500目銅網(wǎng)過濾，488 nm上機檢測。

1.5.2 腎皮質(zhì)細胞HSP70表達 腎組織石蠟切片，切片厚4μm，應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測腎皮質(zhì)細胞中的HSP70，操作按試劑盒說明書進行。HSP70結(jié)果判斷:細胞胞漿呈棕黃色者為HSP70陽性反應(yīng)，不著色者為陰性。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 VE對RI/RI大鼠血清中BUN和Scr的影響

RI/RI后大鼠腎功能明顯受損，YI/R和AI/R組BUN和Scr均分別高于YC和AC組(P＜0.01)，而YI/R+VE和AI/R+VE組BUN和Scr均分別低于YI/R和AI/R組(P＜0.05，P＜0.01，表1)。

2.2 VE對RI/RI大鼠血清中MDA和SOD的影響

YI/R組MDA含量與YC組相比無顯著性差異，AI/R組MDA含量大于AC組，而YI/R+VE和AI/R+VE組MDA含量均分別明顯低于YI/R和AI/R組(表1);YI/R和AI/R組SOD含量均分別明顯低于YC和AC組，而YI/R+VE和AI/R+VE組SOD含量均分別明顯高于YI/R和AI/R組(表1)。

2.3 VE對RI/RI大鼠血清中NO和iNOS的影響

YI/R和AI/R組NO均分別高于YC和AC，而YI/R+VE和AI/R+VE組NO均分別顯著高于YI/R和AI/R組;YI/R和AI/R組iNOS均分別顯著低于YC和AC，而YI/R+VE和AI/R+VE組iNOS均分別顯著低于YI/R和AI/R組(表1)。

2.4 VE對腎皮質(zhì)HSP70表達的影響

YC和AC組正常腎近曲小管上皮細胞，未見棕黃色顆粒。YI/R和AI/R組腎近曲小管上皮細胞明顯壞死并伴有少量的棕黃色顆粒。YI/R+VE和AI/R+VE組腎近曲小管上皮細胞壞死較輕并伴有大量的棕黃色顆粒，并且YI/R+VE組HSP70的表達強于AIR+VE組(圖1)。

2.5 VE對腎皮質(zhì)細胞凋亡的影響

YI/R和AI/R組出現(xiàn)明顯的凋亡峰，凋亡率分別高于YC和AC組;YI/R+VE和AI/R+VE組凋亡率均明顯低于YI/R和AI/R組(圖2)。

Tab.1 Effects of VE on contents of BUN，Scr，MDA，SOD，iNOS and NO in RI/RI rats(，n=6)

Tab.1 Effects of VE on contents of BUN，Scr，MDA，SOD，iNOS and NO in RI/RI rats(，n=6)

YC:Young control;YI/R:Young ischemia/reperfusion;YI/R+VE:Young ischemia/reperfusion+vitamin E;AC:Aged control;AI/R:Aged ischemia/reperfusion;AI/R+VE:Aged ischemia/reperfusion+vitamin E**P＜0.01 vs YC;#P＜0.05 vs YI/R;△△ P＜0.01 vs AC;▲▲ P＜0.01 vs AI/R

Group BUN(mg/L) Scr(mg/L) MDA(nmol/ml) SOD(U/ml) iNOS(U/ml) NO(μmol/L)YC 162.5±40.4 7.7±1.0 1.49±0.32 650.64±42.93 25.59±3.22 9.94±2.96 YI/R 716.3±140.5** 21.0±4.2** 1.55±0.36 527.63±26.98**14.45±0.96** 10.15±1.79**YI/R+VE 351.6±40.6# 13.7±1.1# 1.20±0.25# 632.49±30.10# 11.54±0.85# 16.40±2.43#AC 200.6±30.4 10.8±2.1 1.69±0.38 639.09±27.45 48.31±6.82 1.87±0.41 AI/R 805.5±220.1△△ 26.8±7.0△△ 3.61±0.74△△ 471.51±15.60△△ 21.09±4.29△△ 7.07±0.94△△AI/R+VE 506.4±50.5▲▲ 16.5±1.9▲▲ 2.37±0.41▲▲ 621.71±14.83▲▲ 16.97±5.58▲▲ 10.47±1.35▲▲

Fig.1 Microphotographs showing the expression of HSP 70in renal tubular epithelial cells by immunohistochemistry in different groups(SP×400)

Fig.2 Effect of VE on the apoptosis rate of renal cortex cells in RI/RI rat(ˉx ± s，n=6)

3 討論

本實驗采用我室以往的研究方法[1]，夾閉雙側(cè)腎動、靜脈45 min后恢復(fù)血流，復(fù)制腎缺血/再灌注損傷模型，觀察再灌注后24h青年和老年大鼠的腎功能指標。結(jié)果顯示再灌注后BUN和Scr含量均升高并且老年組升高的更明顯，表明老年大鼠腎功能損傷更嚴重。青年IR組與青年control組相比MDA變化不明顯(P＞0.05)，這可能與青年大鼠體內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)功能較好，能夠在一定范圍內(nèi)抵御外來的或體內(nèi)的氧化損傷有關(guān)。老年IR組MDA含量高于青年IR組而SOD含量低于青年IR組，提示隨著增齡，SOD活性逐漸減低，而MDA含量卻明顯增高與Loong CC等人的報導(dǎo)相一致[2]。SOD的測量可反映組織內(nèi)的自由基水平及脂質(zhì)過氧化的程度[3]?？寡趸瘎┑娜狈κ筊OS等自由基的水平更高，導(dǎo)致腎臟細胞內(nèi)生物大分子的損傷，誘導(dǎo)生命體逐漸衰老。老年大鼠抗氧化酶活性逐漸減弱，當(dāng)發(fā)生缺血/再灌注時，更容易受到自由基的攻擊，引發(fā)腎臟的疾病。Rusting等[4]培養(yǎng)出一種壽命幾乎兩倍于野生型的果蠅，發(fā)現(xiàn)這種長壽命果蠅體內(nèi)的SOD活性非常高。很多實驗也證明SOD減少加重了腎臟氧化損傷[5]，與本實驗研究結(jié)果相吻合。而給予VE治療后BUN、Scr、MDA 較IR組明顯降低，并且青年組降低的更明顯與國外的文獻報道一致[2，6]，其機制可能為:(1)VE可能通過抑制黃嘌呤氧化酶的活性，減少OFR的產(chǎn)生來保護腎臟對抗缺血再灌注損傷[7]，每一摩爾的VE氧化時能還原兩摩爾自由基，它能插入到生物膜中而且其苯環(huán)上酚羥基易失去H+而被氧化，從而清除自由基防止生物膜中磷脂被氧化;(2)VE可提高血漿SOD水平，SOD可使有毒的O2-和H2O2經(jīng)過歧化和還原得到清除，從而阻止其引起自由基的鏈鎖反應(yīng)而降低自由基代謝產(chǎn)物(MDA)的生成;③VE還能提高谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)和過氧化氫酶(CAT)水平，CAT可清除過氧化氫而GSH-Px催化分解部分H2O2，從而使VE清除自由基的范圍更加擴大。

本實驗觀察到，I/R組NO和HSP70表達較正常對照組增加而iNOS表達較正常對照組減弱;I/R+VE組NO和HSP70表達較I/R組增加而iNOS表達含量較I/R組減弱，并且青年組NO和HSP70的表達高于相應(yīng)老年組結(jié)果提示老年大鼠抵抗缺血性損傷的能力逐漸減弱，當(dāng)發(fā)生缺血再灌注時，不容易激發(fā)更多的HSP70來保護腎臟。給予VE后NO含量升高而iNOS表達下降，有文獻報道[8]HSP70能抑制NFkB的活化，NFkB調(diào)控著諸多因子(如細胞因子和iNOS等)的表達[9]。國外實驗研究證實HSP70可以抑制人成纖維細胞中iNOS的表達[10]。本實驗結(jié)果中NO含量增加可能是HSP70抑制iNOS的表達，從而直接或間接的促進了由cNOS誘導(dǎo)的具有保護作用的NO表達。

一些研究表明，RI/RI時NO產(chǎn)生增多。其機制為:RI/RI時縮血管物質(zhì)產(chǎn)生增多，機體為了維持組織器官的血流灌注，NO生成增多，對機體發(fā)揮生理性的保護作用本實驗中I/R組腎皮質(zhì)細胞凋亡顯著，I/R+VE組腎皮質(zhì)細胞凋亡明顯輕于IR組?？赡苁荲E促進HSP70大量表達，抑制NFkB的活化，從而抑制參與凋亡的促炎因子表達，降低腎皮質(zhì)細胞的凋亡。由cNOS誘導(dǎo)的NO可能通過以下途徑保護腎臟，抑制凋亡:(1)生理性調(diào)節(jié)血管緊張性，抑制血小板聚集、減少白細胞粘附于血管內(nèi)皮細胞、清除氧自由基、維持血管滲透壓。(2)抑制平滑肌細胞增殖、免疫防御、刺激內(nèi)皮細胞再生。(3)與自發(fā)或SOD歧化的O2發(fā)生反應(yīng)來減少H2O2在缺血器官的聚集，避免其轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂懈蠹毎拘缘腛H-損傷內(nèi)皮細胞。

程序化細胞死亡通路的激活在RI/RI機制中起重要作用，隨著年齡的增長機體清除自由基的能力以及激發(fā)HSP70和NO的能力越來越弱，當(dāng)遭遇RI/RI時腎皮質(zhì)細胞凋亡的更嚴重，在缺血再灌注前灌胃給予VE，可顯著保護老年大鼠缺血再灌注腎臟的功能，減輕腎臟的結(jié)構(gòu)損傷，縮小損傷范圍，加之其具有藥源廣泛、吸收迅速等特點，因此，進一步對VE開展深入研究將可能為臨床防治老年腎缺血再灌注損傷提供新的可能性。

[1]夏曉紅，申玉學(xué)，石紀才，等.內(nèi)皮素抗體在大鼠腎缺血/再灌注損傷的作用[J].中國病理生理雜志，1999，15(5):415-417.

[2]Loong C C，Chang Y H，Wu T H，et al.Antioxidant supplementation may improve renal transplant function:a preliminary report[J].Transplant Proc，2004，36(8):2438-2439.

[3]Yokoyama I，Negita M，Liu D G，et al.Prevention of freeradical induced apoptosis by induction of human recombinant Cu，Zn-SOD in pig endothelial cells[J].Transpl Int，2002，15(5):220-225.

[4]Rusting R L.Why do we age[J]?Sci Am，1992，267(6):130-135.

[5]Son D，Kojima I，Inagi R，et al.Chronic hypoxia aggravates renal injury via suppression of Cu/Zn-SOD:a proteomic analysis[J].Am J Physiol Renal Physiol，2008，294(1):62-72.

[6]Shimizu M H，Araujo M，Borges S M，et al.Influence of age and vitamin E on post-ischemic acute renal failure[J].Exp Gerontol，2004，39(5):825-830.

[7]Unal D，Yeni E，Erel O，et al.Antioxidative effects of exogenous nitric oxide versus antioxidant vitamins on renal ischemia reperfusion injury[J].UrolRes，2002，30(3):190-194.

[8]Chen H，Wu Y，Zhang Y，et al.Hsp70inhibits lipopolysaccharide induced NF-kappaB activation by interacting with TRAF6 and inhibiting its ubiquitination[J].FEBS Lett，2006，580(13):3145-3152.

[9]劉少青，姜佑三，權(quán)昌益，等.HSP 70和iNOS的表達在大鼠腎臟缺血再灌注損傷中的作用[J].中華泌尿外科雜志，2001，15(4):245.

[10]RenisM，Cardile V，Grasso S，et al.Switching of HSP70and i-NOS to study their role in normal and H2O2-stressed human fibroblasts[J].Life Sci，2003，74(6):757-769.