陳萬(wàn)一，何海霞，李秋波，馮曉科，康紀(jì)平，周遠(yuǎn)大（1.重慶市腫瘤研究所，重慶市 40000；.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院臨床藥理研究室，重慶市 400016；.四川省養(yǎng)麝研究所，都江堰市 61180）

青藤堿（Sinomenine）具有抗炎、鎮(zhèn)痛、解熱和免疫調(diào)節(jié)[1]的作用。青藤堿腸溶片臨床上用于治療類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，療效較好[2]。其在大鼠、家兔體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)研究已有報(bào)道[3，4]，而在Beagle犬體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)研究尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。為此，本文建立了以高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定青藤堿腸溶片給藥后在Beagle犬體內(nèi)血藥濃度的方法，并進(jìn)行了藥動(dòng)學(xué)研究。

1 材料

1.1 儀器

1100 HPLC儀（美國(guó)Agilent公司）；pHS-3C酸度計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；VXH-3型快速混合器（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）；B160A型醫(yī)用低速離心機(jī)（河北省安新縣白洋離心機(jī)廠）；BP61型電子天平（德國(guó)Startorious公司）。

1.2 試藥

青藤堿腸溶片（商品名為正清風(fēng)痛寧片，西安利君制藥有限責(zé)任公司，批號(hào)：0707291，規(guī)格：每片20 mg）；內(nèi)標(biāo)去水嗎啡注射液（沈陽(yáng)第一制藥廠，批號(hào)：20020613，規(guī)格：5 mg∶mL－1）；青藤堿對(duì)照品（西安賽邦醫(yī)藥科技有限公司，批號(hào)：20070402，純度：98%）；二氯甲烷為色譜純，其余試劑均為分析純。

1.3 動(dòng)物

健康Beagle犬8只，體質(zhì)量（10±0.8）kg，♀♂各半，四川養(yǎng)麝研究所提供，質(zhì)量合格證號(hào)和環(huán)境設(shè)施合格證號(hào)分別為川實(shí)動(dòng)管第63號(hào)和第64號(hào)。

2 方法與結(jié)果

2.1 血藥濃度測(cè)定方法的建立

2.1.1 色譜條件。色譜柱為Phenomenex Gemini C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為甲醇-0.01 mol·L－1磷酸二氫鈉-三乙胺（55∶45∶0.1，調(diào)pH至7），流速為0.8 mL·min－1，內(nèi)標(biāo)為去水嗎啡，檢測(cè)波長(zhǎng)為262 nm，柱溫為30℃，進(jìn)樣量為50 μL。

2.1.2 專(zhuān)屬性試驗(yàn)。在選定的色譜條件下，取青藤堿對(duì)照品+內(nèi)標(biāo)溶液、空白血漿、空白血漿+青藤堿對(duì)照品+內(nèi)標(biāo)及Beagle犬給藥1 h后血漿樣品，進(jìn)樣分析，色譜見(jiàn)圖1。

由圖1可見(jiàn)，青藤堿與內(nèi)標(biāo)峰形尖銳，與血漿中內(nèi)源性物質(zhì)及其它雜質(zhì)分離良好，保留時(shí)間分別為10、13 min。

2.1.3 青藤堿對(duì)照品溶液制備。精密稱(chēng)取青藤堿對(duì)照品適量，用甲醇溶解并定容，制備成300 μg·mL－1的貯備液，于4 ℃保存。臨用前，用犬空白血漿按倍數(shù)稀釋法稀釋至所需濃度，即得青藤堿的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

2.1.4 內(nèi)標(biāo)溶液制備。取1支去水嗎啡注射液，加甲醇制備成200 μg·mL－1的貯備液，于4 ℃保存。臨用前，加水稀釋成40 μg·mL－1，即得內(nèi)標(biāo)工作液。

2.1.5 樣品處理。取血漿樣品0.4 mL，加入內(nèi)標(biāo)50 μL（40 μg·mL－1），混合均勻，加入二氯甲烷4 mL，漩渦混勻1 min后3500 r·min－1離心5 min，靜置分層。取二氯甲烷層清液，50℃水浴中氮?dú)獯蹈桑鲃?dòng)相100 μL復(fù)溶，每次進(jìn)樣50 μL。

圖1 高效液相色譜圖A.青藤堿對(duì)照品+內(nèi)標(biāo)；B.空白血漿；C.空白血漿+青藤堿對(duì)照品+內(nèi)標(biāo)；D.血漿樣品；1.青藤堿；2.內(nèi)標(biāo)Fig 1 HPLC chromatographyA.sinomenine control+internal standard；B.blank plasma；C.blank plasma+sinomenine control+internal standard；D.plasma sample；1.sinomenine；2.internal standard

2.1.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍和最低定量濃度。分別取青藤堿貯備液適量及犬空白血漿，制成濃度為90、45、22.5、4.5、0.45、0.045、0.0075 μg·mL－1的青藤堿血漿樣品，按“2.1.5”項(xiàng)下方法處理，進(jìn)樣，所得數(shù)據(jù)以血漿中青藤堿的濃度X對(duì)青藤堿與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值Y進(jìn)行線性回歸，得血漿中青藤堿的標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y＝0.3920X+0.7052（r＝0.9991）。結(jié)果表明，青藤堿檢測(cè)濃度在0.0075～90 μg·mL－1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，最低定量濃度為0.0075 μg·mL－1（RSD＝9.23%，n＝5）。

2.1.7 回收率和精密度。取青藤堿貯備液適量及犬空白血漿，制成高、中、低濃度（45、4.5、0.045 μg·mL－1）樣品，按“2.1.5”項(xiàng)下方法處理，評(píng)價(jià)本法的方法回收率與萃取回收率（含藥血漿經(jīng)樣品處理所得測(cè)定值與同時(shí)用流動(dòng)相配制的同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液測(cè)定值計(jì)算萃取回收率）及日內(nèi)精密度（每個(gè)濃度同日內(nèi)測(cè)定5次）、日間精密度（每個(gè)濃度連續(xù)測(cè)5 d，每天測(cè)1次），結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 回收率及精密度試驗(yàn)結(jié)果（n＝5）Tab 1 Recovery rate and precision tests（n＝5）

2.2 給藥及血藥濃度測(cè)定

選取8只Beagle犬，♀♂各半，實(shí)驗(yàn)前禁食12 h后，根據(jù)臨床人用劑量，于次日晨8時(shí)空腹灌服10 mg·kg－1青藤堿腸溶片，分別于給藥后0、15、30、60、90、120、240、480 min，從前肢靜脈取血2 mL，分離血漿，按“2.1.5”項(xiàng)下方法處理進(jìn)樣，以青藤堿峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積之比值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算血藥濃度，平均藥-時(shí)曲線見(jiàn)圖2。

2.3 藥動(dòng)學(xué)參數(shù)

采用3p97計(jì)算機(jī)軟件選擇最佳房室模型，結(jié)果Beagle犬按10 mg·kg－1量口服青藤堿腸溶片后在體內(nèi)的血藥濃度-時(shí)間曲線經(jīng)擬合后為一室開(kāi)放模型，計(jì)算求得其藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見(jiàn)表2。

圖2 犬單劑量口服10 mg·kg－1青藤堿腸溶片后的平均血藥濃度-時(shí)間曲線Fig 2 Mean plasma concentration-time curves in dogs after administration of single oral dose of 10 mg·kg－1sinomenine enteric tablets

表2 青藤堿腸溶片在犬體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（n＝8）Tab 2 Pharmacokinetic parameters of sinomenine enteric tablets in dogs（n＝8）

3 討論

在文獻(xiàn)[5，6]報(bào)道的測(cè)定青藤堿濃度的HPLC法中，主要采用氨基比林或者氯霉素作為內(nèi)標(biāo)，但在本實(shí)驗(yàn)室條件下，效果均不理想。筆者經(jīng)多次預(yù)試驗(yàn)及改進(jìn)[3]，最終采用去水嗎啡為內(nèi)標(biāo)，選取流動(dòng)相甲醇-0.01mol·L－1磷酸二氫鈉的比例為55∶45，結(jié)果取得了良好的分離分析效果。

已有文獻(xiàn)[2～4]報(bào)道了口服青藤堿后在大鼠、家兔體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，Beagle犬服用青藤堿腸溶片后血藥濃度迅速升高，血藥濃度-時(shí)間曲線經(jīng)擬合后符合一室開(kāi)放模型，且根據(jù)CL/F（s）值（（0.36±0.12）L·min－1）和tmax值（（69.66±16.41）min），提示本品吸收及消除均較快，為其臨床用藥提供了依據(jù)。

[1]孔慶峰，李 軍.青藤堿凝膠的制備及質(zhì)量控制[J].中國(guó)中藥雜志，2005，30（20）：1573.

[2]陳順樂(lè)，鮑春德，陳湘君，等.利君正清風(fēng)痛寧片治療類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的療效觀察[J].中國(guó)藥房，2000，11（3）：126.

[3]張斯?jié)h，周遠(yuǎn)大，何海霞.正清風(fēng)痛寧腸溶片的生物等效性研究[J].中國(guó)中藥雜志，2008，33（6）：684.

[4]劉啟德，梁美蓉，歐衛(wèi)平，等.青藤堿時(shí)辰藥代動(dòng)力學(xué)研究[J].中藥新藥與臨床藥理，1995，6（1）：24.

[5]楊廣德，劉軍保，王志軍，等.反相高效液相法測(cè)定血漿中青藤堿的含量[J].中國(guó)藥學(xué)雜志，1993，28（3）：152.

[6]張先洲，周延安，羅順德，等.青藤堿凝膠劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J].醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2003，22（8）：571.