鄧守恒，李程，楊君君，邱美紅，吳松松，陳萍（1.鄖陽醫(yī)學院附屬人民醫(yī)院，十堰市 44000；.鄖陽醫(yī)學院，十堰市 44000）

硒化殼聚糖[1]是將殼聚糖與亞硒酸在酸性條件下，以混合金屬離子為催化劑，通過拼合原理制備而成的一種有機硒，可有效克服無機硒不易被細胞吸收、活性和毒性范圍較窄、致死量相對較小等缺點[2]，目前正對其抗腫瘤作用進行研究。硒和砷屬同族，而砷（三氧化二砷）在臨床上早已做為一種抗早幼粒白血病藥物使用，故推導硒化殼聚糖可能也具有抗早幼粒白血病的作用，且毒副作用應(yīng)該比無機硒和砷小得多。本試驗即以人早幼粒白血病細胞株HL60為靶細胞，觀察硒化殼聚糖對其產(chǎn)生的誘導分化作用并探討了可能的作用機制，為硒化殼聚糖用于治療人早幼粒白血病奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 試藥

硒化殼聚糖（由福建醫(yī)科大學藥化系合成，經(jīng)中科院福建物質(zhì)結(jié)構(gòu)所檢測，批號：100601-200518，含硒量：0.4%）；佛波酯（TPA）、硝基藍四氮唑（NBT）、二甲基亞砜（DMSO）均為美國Sigma公司產(chǎn)品；鼠抗人c-myc單抗、羊抗鼠異硫氰酸鹽FITC-IgG二抗，兔抗人c-fos多抗、羊抗兔異硫氰酸鹽FITC-IgG二抗均購自美國Santa Cruze公司。

1.2 細胞

人早幼粒細胞性白血病細胞株HL60細胞由福建省血液病研究所提供。

1.3 儀器

Epics Elite ESP型流式細胞儀（美國Coulter公司）。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)

取HL60細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 IU·mL－1青霉素、100 IU·mL－1鏈霉素和2 IU·mL－1谷氨酰胺的RPMI 1640培養(yǎng)基內(nèi)，于37℃、飽和濕度，5%CO2條件下培養(yǎng)，細胞接種24 h后即處于指數(shù)生長期。

2.2 NBT還原法檢測硒化殼聚糖對HL60細胞的誘導分化作用[3]

取HL60細胞接種于24孔培養(yǎng)板中，每孔1 mL，接種濃度為每毫升2×105個。給藥組分別加入1 mL由培養(yǎng)液制備成的50、100、200 mg·L－1硒化殼聚糖應(yīng)用液，使其終濃度分別達到25、50、100 mg·L－1；空白對照組加入1mL培養(yǎng)液；每孔總體積為2 mL，并設(shè)1.4%DMSO為陽性對照組。培養(yǎng)48 h后，光鏡下觀察各組細胞形態(tài)改變，取藥物處理后的細胞懸液離心（1000 r·min－1）3 min，棄上清液，往細胞沉淀中加入0.5 mL NBT反應(yīng)液（NBT0.2%，TPA以磷酸鹽緩沖液（PBS）為溶劑制備成濃度600 ng·mL－1），37 ℃孵育1 h，加入冰冷PBS終止反應(yīng)，離心（1000 r·min－1）3 min，棄上清液，制備細胞涂片，瑞氏染液染色1 min，自來水沖洗晾干后油鏡下觀察，細胞內(nèi)染有藍色顆粒者為NBT陽性細胞。試驗重復(fù)4次。

2.3 分化相關(guān)蛋白c-myc和c-fos檢測[3]

收集經(jīng)不同濃度藥物處理一定時間后的HL60細胞2.5×106個，用PBS洗2次后，加1 mL預(yù)冷（4℃）70%乙醇固定，－20℃保持12 h以上。用前離心去除固定液，PBS洗2次，調(diào)節(jié)細胞濃度為每毫升1.5×106個。各取200 μL此細胞懸液，分別加入1∶100稀釋的鼠抗人c-myc單抗200 μL，37℃孵育30 min，PBS洗2次，棄上清液，再分別加入1∶100稀釋的羊抗鼠FITC-IgG二抗150 μL，37 ℃避光孵育30 min，PBS洗2次，于流式細胞儀上檢測，并得出c-myc陽性表達率（陽性表達率＝FITC對數(shù)值/檢測細胞數(shù)×100%）；c-fos檢測細胞培養(yǎng)、分組同c-myc檢測，分別加入1∶200稀釋的兔抗人c-fos多抗200 μL，37 ℃孵育30 min，PBS洗2次，棄上清液，再加入1∶100稀釋的羊抗兔FITC-IgG二抗150 μL，37℃避光孵育30 min，PBS洗2次，于流式細胞儀上檢測其陽性表達率。

2.4 統(tǒng)計分析

3 結(jié)果

3.1 硒化殼聚糖對HL60細胞分化的影響

空白對照組、硒化殼聚糖50 mg·L－1組及陽性對照組細胞光鏡下觀察結(jié)果見圖1。

由圖1可見，對空白對照組比較，硒化殼聚糖組形態(tài)上有趨向成熟分化的特征，表現(xiàn)為細胞密度較小，且細胞形態(tài)不規(guī)則，細胞體積變小，胞漿增多，核縮小，核漿比例減少，細胞核由圓、橢圓轉(zhuǎn)變?yōu)槟I形、桿狀、分葉，分類計數(shù)結(jié)果顯示成熟的細胞主要為中幼粒細胞，晚幼粒細胞和桿狀核細胞少于5%，這與陽性對照組結(jié)果很相似；同時細胞內(nèi)藍色顆粒增多，數(shù)量低于陽性對照組。

圖1 各組細胞分化光鏡下觀察結(jié)果a.空白對照組；b.硒化殼聚糖50 mg·L－1組；c.陽性對照組Fig 1 Differentiation of HL60 cell under light microscope of each groupa.blank control group；b.50 mg·L－1selenium chitosan group；c.positive control group

3.2 分化相關(guān)蛋白檢測結(jié)果

各組分化相關(guān)蛋白c-myc檢測結(jié)果見圖2，c-fos檢測結(jié)果見圖3，定量結(jié)果見表1。

圖2 各組細胞c-myc陽性表達情況a.空白對照組；b.硒化殼聚糖25 mg·L－1組；c.硒化殼聚糖50 mg·L－1組；d.硒化殼聚糖100 mg·L－1組；e.陽性對照組Fig 2 Protein expression of c-myc in cell of each groupa.blank control group；b.25 mg·L－1selenium chitosan group；c.50 mg·L－1selenium chitosan group；d.100 mg·L－1selenium chitosan group；e.positive control group

圖3 各組細胞c-fos陽性表達情況a.空白對照組；b.硒化殼聚糖25 mg·L－1組；c.硒化殼聚糖50 mg·L－1組；d.硒化殼聚糖100 mg·L－1組；e.陽性對照組Fig 3 Protein expression of c-fos in cell of each groupa.blank control group；b.25 mg·L－1selenium chitosan group；c.50 mg·L－1selenium chitosan group；d.100 mg·L－1selenium chitosan group；e.positive control group

流式細胞儀分析顯示，硒化殼聚糖對HL60細胞c-myc基因表達有明顯抑制作用（P＜0.05，P＜0.01），同時可增強c-fos基因的表達（P＜0.05，P＜0.01）。與空白對照組相比，經(jīng)不同濃度的硒化殼聚糖作用48 h后，HL60細胞c-myc蛋白表達水平下降了26.2%～61.3%，c-fos蛋白表達水平則提高了42%～140%。

表1 各組細胞c-myc和c-fos表達陽性率結(jié)果（n＝6）Tab 1 Positive expression rate of c-myc and c-fos molecules in cell of each group（n＝6）

4 討論

硒是人和動物體內(nèi)必需的微量元素之一，大量的流行病學調(diào)查和體內(nèi)、外實驗都已證實硒對包括血液病在內(nèi)的多種腫瘤都具有顯著的預(yù)防和治療作用[4]。然而常用的無機補硒劑如亞硒酸鈉雖然含硒量高，但具有不易被細胞吸收、活性和毒性范圍較窄、半數(shù)致死量（LC50）相對較小，以及蓄積性毒性和致突變作用、使用時劑量難以控制等缺點而應(yīng)用受限。硒化殼聚糖是有機硒，可克服無機硒的上述缺點，理論上應(yīng)該比無機硒具有更強的抗腫瘤作用，且毒副作用應(yīng)該小得多。

HL60細胞可在多種分化誘導物的作用下分化為中性粒細胞或巨噬細胞，其中DMSO可誘導其沿粒系途徑分化成熟[5]，在誘導HL60細胞向正常細胞方向分化成熟過程中，糖代謝活躍，代謝產(chǎn)物大量釋放氫，氫能將無色染料NBT還原沉淀于胞質(zhì)內(nèi)，呈藍黑色顆粒，這種細胞即為NBT還原陽性細胞，是細胞分化成熟的重要標志。本研究結(jié)果顯示，HL60細胞經(jīng)25、50、100 mg·L－1硒化殼聚糖或1.4%DMSO處理48 h后，細胞在形態(tài)上出現(xiàn)了趨向粒系成熟分化的特征，尤其以50 mg·L－1硒化殼聚糖組最明顯，同時也逐步具有了成熟細胞還原NBT的功能，但作用弱于1.4%DMSO組，由此提示，50 mg·L－1左右濃度的硒化殼聚糖有誘導HL60細胞沿“粒系”成熟方向分化的作用。

既往研究[6]表明，許多誘導分化劑誘導腫瘤細胞分化是由于某些癌基因表達的抑制、失活或活化所致。其中c-myc基因編碼的核蛋白可影響和調(diào)控細胞的增殖與分化，其過度表達使大量G1期細胞提前進入S期，從而促進細胞增殖、抑制細胞分化，導致細胞惡性轉(zhuǎn)化和腫瘤形成，而其表達下降則與腫瘤細胞的形態(tài)改變和分化密切相關(guān)，當HL60細胞受誘導分化劑作用向成熟粒細胞或單核細胞分化時，c-myc的表達減弱。c-fos基因主要分布在胞漿中，在成熟的粒細胞和單核細胞中高度表達，在未分化的人早幼粒細胞中卻不表達。分化誘導劑誘導此類細胞向成熟細胞分化時，c-fos基因表達明顯增強，因此認為c-fos基因是細胞分化的標志[7]。本結(jié)果顯示，經(jīng)硒化殼聚糖作用后的HL60細胞c-myc蛋白表達下降，c-fos蛋白表達升高，此結(jié)果與大多數(shù)分化誘導劑的作用相似[8]。因此，硒化殼聚糖可能通過調(diào)控增殖、分化相關(guān)基因c-myc和c-fos表達來促進HL60細胞分化，硒化殼聚糖的藥用價值值得進一步研究。

[1]鄧守恒，孫各琴，陳崇宏，等.硒化殼聚糖對NB4細胞的周期阻斷及與阿霉素的協(xié)同作用[J].中國藥房，2007，18（10）：741.

[2]李柱來，林 媚，王 晶，等.硒化殼聚糖的制備及其表征[J].海峽藥學，2005，17（3）：10.

[3]Dimberg A，Bahram F，Karlberg I，et al.Retinoic acidinduced cell cycle arrest of human myeloid cell lines is associated with sequential down-regulation of c-myc and cyclin E and posttranscriptional up-regulation of p27Kip1[J].Blood，2002，99（6）：2199.

[4]Schrauzer GN.Effects of selenium and low levels of lead on mammary tumordevelopmentand growth in MMTV-infected female mice[J].Biol Trace Elem Res，2008，25（3）：268.

[5]Bondner AJ，Ting RC，Gallaghar R，et al.Induction of human promyelocytic leukemia cells（HL-60）by nucleosides and methotrexate[J].J Cancer Inst，1981，67（5）：1025.

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