仇 燕（南華大學(xué)附屬南華醫(yī)院，衡陽市 421002）

長春堿（Vinblastine，VBL）是一種二聚吲哚類生物堿，屬于長春堿類化合物。長春堿于1958年從長春花中提取出來，1970年后被廣泛應(yīng)用于臨床腫瘤的治療中，具有良好的抑制多種惡性腫瘤生長的作用，用于如何杰金氏病、絨毛膜上皮癌、急性白血病、乳腺癌和口咽部癌等的治療中[1]。有關(guān)長春堿的研究雖報(bào)道較多，但有關(guān)其在免疫學(xué)方面的研究罕見報(bào)道。固有免疫是免疫系統(tǒng)的第一道防護(hù)線，而巨噬細(xì)胞在固有免疫應(yīng)答中起著重要的作用[2]。故筆者以巨噬細(xì)胞（RAW264.7細(xì)胞）增殖和分泌一氧化氮（NO）等細(xì)胞行為變化為靶點(diǎn)，研究長春堿對其的影響，以為篩選和開發(fā)新型免疫調(diào)節(jié)藥提供新策略。

1 材料

1.1 試藥

脂多糖（LPS）、二甲基亞砜（DMSO）、MTT、碘化丙啶（PI）、抗β肌動蛋白單克隆抗體（Anti-beta-actin mAb）、抗鼠細(xì)胞周期蛋白B1單克隆抗體（Anti-mouse cyclin B1 mAb）、辣根過氧化酶標(biāo)志的羊抗鼠IgG（HRP-goat Anti-mouse IgG）和長春堿（批號：V1377，純度：≥96%）均由美國Sigma公司提供；DMEM培養(yǎng)基低糖（干粉）和胎牛血清均由美國Gibco-BRL公司提供；Griess檢測試劑盒（美國Promega公司）；凱基Super ECL檢測液（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司）；其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 細(xì)胞

RAW264.7細(xì)胞系購自武漢大學(xué)典型培養(yǎng)物保藏中心。

1.3 儀器

680型酶標(biāo)儀、PowerPac Basic型電泳儀（美國Bio-RAD公司）；FACSCalibur流式細(xì)胞儀（美國Becton Dickinson公司）；IX70倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；2300型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國Sheldon公司）；SW-CJ-IF型潔凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備廠）；Megafuge 1.0R型低溫離心機(jī)（德國Herculeus公司）。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

取RAW264.7細(xì)胞于DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)生長期，用 0.25%胰酶消化液消化，離心（125 r·min－1，5 min，20℃），調(diào)整細(xì)胞密度為每升5×108個(gè)，并接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔定容200 μL，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。

2.2 MTT法檢測長春堿對RAW264.7細(xì)胞增殖的影響

試驗(yàn)分為對照組（含0.01%DMSO的DMEM 10 μL）和實(shí)驗(yàn)組，即長春堿低、中、高濃度（50、100、150 μmol·L－1）組。取“2.1”項(xiàng)培養(yǎng)24 h后的細(xì)胞，每孔加入10 μL不同濃度的VBL（終濃度分別為50、100、150 μmol·L－1），每一濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。每孔加入20 μL MTT工作液，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育4 h，離心（300 r·min－1，5 min），吸掉上清液體，每孔加入100 μL DMSO，振蕩器上振蕩10 min，酶標(biāo)儀540 nm波長檢測吸光度（A）值，并計(jì)算細(xì)胞相對抑制率。細(xì)胞相對抑制率＝（1－實(shí)驗(yàn)組A均值/對照組A均值）×100%。

2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期分布

試驗(yàn)分組和藥物的處理同“2.2”項(xiàng)，48 h后收集細(xì)胞，用冷的磷酸鹽緩沖溶液（PBS）洗滌，離心（125 r·min－1，5 min，4℃），用300 μL PBS重懸（含10%普通級小牛血清），加入700 μL冷無水乙醇，4℃固定30 min，冷PBS重懸洗滌細(xì)胞2次，加入300 μL PI染液（含RNase），避光15 min，立即進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測，并以ModFit軟件分析，擬合計(jì)算各時(shí)相細(xì)胞的百分比。

2.4 Western blot法檢測cyclin B1的表達(dá)情況

試驗(yàn)分組和藥物的處理同“2.2”項(xiàng)，48 h后收集細(xì)胞，PBS洗滌2次，裂解，離心，收集上清液，即細(xì)胞總蛋白，用二喹啉甲酸（BCA）法定量蛋白，調(diào)正蛋白濃度，用等量蛋白和蛋白上樣緩沖液混合，煮沸，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），電泳后轉(zhuǎn)硝酸纖維素膜（NC膜），依次孵抗體，即抗鼠細(xì)胞周期蛋白B1單克隆抗體和辣根過氧化酶標(biāo)志的羊抗鼠IgG，用ECL檢測液發(fā)光，并顯影定影，最后用Quantity one分析軟件計(jì)算條帶灰度。

2.5 Griess試劑盒檢測NO分泌

試驗(yàn)分為對照組、LPS 組、LPS+長春堿（50、100、150 μmol·L－1）組。取“2.1”項(xiàng)培養(yǎng)24 h 后的細(xì)胞，每孔加10 μL 不同濃度的長春堿（終濃度分別為50、100、150 μmol·L－1），每一濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育4 h，加入LPS（終濃度10 mg·L－1）繼續(xù)培養(yǎng)。24 h后，按照試劑盒說明書操作并制備NO標(biāo)準(zhǔn)曲線，用校準(zhǔn)曲線確定試驗(yàn)各組NO的分泌量。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 長春堿對RAW264.7細(xì)胞增殖的影響

MTT法檢測RAW264.7細(xì)胞增殖的結(jié)果詳見表1。

根據(jù)MTT的工作原理，A值與活細(xì)胞數(shù)量成正比。從表1中可以看出，隨著長春堿濃度的升高，A值逐漸下下降，說明RAW264.7細(xì)胞的增殖受抑程度增強(qiáng)，具有濃度依賴性（P＜0.05或P＜0.01）。

表1 各組細(xì)胞相對抑制率結(jié)果（，n＝3）Tab 1 Relative inhibition of cells in each group（，n＝3）

表1 各組細(xì)胞相對抑制率結(jié)果（，n＝3）Tab 1 Relative inhibition of cells in each group（，n＝3）

與對照組比較：＊P＜0.05，#P＜0.01vs.control group：＊P＜0.05，#P＜0.01

A組別對照組長春堿50 μmol·L－1組長春堿100 μmol·L－1組長春堿150 μmol·L－1組3.010±0.0952.512±0.066＊1.933±0.048#1.150±0.017#細(xì)胞相對抑制率/%—16.535.861.8

3.2 長春堿對RAW264.7細(xì)胞細(xì)胞周期的阻斷

流式細(xì)胞術(shù)檢測長春堿對RAW264.7細(xì)胞細(xì)胞周期阻斷的結(jié)果詳見表2。

表2 各組細(xì)胞周期時(shí)相分布情況（，n＝3）Tab 2 Distribution of cycle phases of cells in each group（，n＝3）

表2 各組細(xì)胞周期時(shí)相分布情況（，n＝3）Tab 2 Distribution of cycle phases of cells in each group（，n＝3）

與對照組比較：＊P＜0.05，#P＜0.01vs.control group：＊P＜0.05，#P＜0.01

從表2中可見，隨著長春堿濃度的升高，G2～M期細(xì)胞呈濃度依賴性增加，而G0～G1期和S期細(xì)胞則逐漸減少（P＜0.05，P＜0.01）。

3.3 長春堿對RAW264.7細(xì)胞表達(dá)cyclin B1的影響

Western blot法檢測長春堿對RAW264.7細(xì)胞表達(dá)cyclin B1影響的結(jié)果詳見圖1。用Quantity One分析軟件對圖1進(jìn)行灰度計(jì)算，并與β-actin比較，得到半定量結(jié)果，詳見表3。

圖1 各組細(xì)胞表達(dá)cyclin B1情況1.對照組；2.長春堿 50 μmol·L－1組；3.長春堿 100 μmol·L－1組；4.長春堿 150 μmol·L－1組Fig 1 Expression of cyclin B1 in each group1.control group；2.50 μmol·L－1vinblastine group；3.100 μmol·L－1 vinblastine group；4.150 μmol·L－1vinblastine group

表3 各組細(xì)胞表達(dá)cyclin B1的半定量結(jié)果Tab 3 Semi-quantitative analysis of the expression of cyclin B1 in each group

從圖1和表3可見，對照組cyclin B1的條帶最明顯，其條帶灰度比值為1.21，經(jīng)50 μmol·L－1、100 μmol·L－1和150 μmol·L－1長春堿作用后，cyclin B1蛋白條帶變淺，條帶灰度比值也相應(yīng)減少，并具有濃度依賴性。

3.4 長春堿對RAW264.7細(xì)胞分泌NO的影響

將一系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品與測定的對應(yīng)A值作標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進(jìn)行直線相關(guān)回歸分析，得出NO量（Y）與A值的回歸方程為Y＝0.024+0.009A（r＝0.998）。將不同組樣品測得的A值代入該直線回歸方程中，即得到相應(yīng)的NO量，結(jié)果詳見表4。

表4 各組細(xì)胞NO分泌量結(jié)果（，n＝3）Tab 4 Result of NO secretion of cells in each group（，n＝3）

表4 各組細(xì)胞NO分泌量結(jié)果（，n＝3）Tab 4 Result of NO secretion of cells in each group（，n＝3）

與對照組比較：※P＜0.01；與LPS組比較：＊P＜0.05，#P＜0.01vs.control group：※P＜0.01；vs.LPS group：＊P＜0.05，#P＜0.01

NO分泌量/nmol·L－1 1.70±0.3220.38±3.15※15.21±2.36＊12.56±1.98#7.12±2.87#組別對照組LPS組LPS+長春堿50 μmol·L－1組LPS+長春堿100 μmol·L－1組LPS+長春堿150 μmol·L－1組

從表4可見，經(jīng)LPS刺激，RAW264.7細(xì)胞大量分泌NO（P＜0.01）；但隨著長春堿濃度的升高，LPS刺激的RAW264.7細(xì)胞分泌NO的量逐漸減少，并具有濃度依賴性（P＜0.05或P＜0.01）。

4 討論

微管骨架是一個(gè)動態(tài)網(wǎng)絡(luò)，由微管蛋白的結(jié)合與分離維持細(xì)胞的動態(tài)變化，如細(xì)胞的分裂和增殖[3]。多年的研究表明，長春堿通過與微管蛋白二聚體結(jié)合，抑制紡錘體的形成，使細(xì)胞分裂停滯在M期，從而最終抑制腫瘤細(xì)胞的生長[4]。本研究將長春堿作用于RAW264.7細(xì)胞，MTT檢測結(jié)果表明，長春堿具有抑制RAW264.7細(xì)胞增殖的作用；而PI染色檢測細(xì)胞周期分布的結(jié)果進(jìn)一步表明，長春堿使RAW264.7細(xì)胞停滯于G2～M期，這恰好與前人的研究結(jié)果[4]相一致。

細(xì)胞周期是由細(xì)胞周期蛋白（cyclin）和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）共同驅(qū)動的。不同類型的cyclin隨細(xì)胞周期進(jìn)程在不同的時(shí)相出現(xiàn)，依次激活相應(yīng)的CDK，驅(qū)動細(xì)胞完成由G1→S→G2→M的轉(zhuǎn)換，然后被降解[5]。在眾多cyclin中，cyclin B1在推動細(xì)胞進(jìn)入G2～M期中起著關(guān)鍵性的作用。研究表明，cyclin B1從G1晚期開始表達(dá)，到G2后期達(dá)到高峰，M期中期被迅速降解。其高峰時(shí)活性最佳，并激活CDK1，推動細(xì)胞進(jìn)入G2～M期[6]。本研究Western blot法結(jié)果表明，長春堿具有抑制RAW264.7細(xì)胞表達(dá)cyclin B1的作用。這可能是長春堿使RAW264.7細(xì)胞細(xì)胞周期停滯于G2～M期，抑制RAW264.7細(xì)胞增殖的分子機(jī)制之一。

NO是一種氣體信號分子，能夠進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，直接作用于相關(guān)酶，引起細(xì)胞的快速反應(yīng)[7]。RAW264.7細(xì)胞來源于小鼠的巨噬細(xì)胞系，而巨噬細(xì)胞通過分泌細(xì)胞因子和吞噬異物，在天然免疫應(yīng)答中起著重要的作用。被激活的巨噬細(xì)胞能夠分泌NO，而NO是巨噬細(xì)胞發(fā)揮吞噬功能的基本條件。隨著NO的減少，巨噬細(xì)胞的吞噬功能也相應(yīng)地減弱[8]。本研究Griess試劑盒檢測結(jié)果顯示，長春堿能顯著抑制LPS刺激的RAW264.7細(xì)胞分泌NO，并具有濃度依賴性。這暗示著長春堿不但能夠抑制RAW264.7細(xì)胞的增殖，還能抑制RAW264.7細(xì)胞的生物學(xué)功能。

本研究證明長春堿不但能抑制RAW264.7細(xì)胞表達(dá)cyclin B1，使細(xì)胞周期停滯于G2～M期，從而抑制了RAW264.7細(xì)胞的增殖，而且還能抑制LPS刺激的RAW264.7細(xì)胞分泌NO，影響RAW264.7細(xì)胞的生物學(xué)行為。這不但豐富了長春堿的藥理作用內(nèi)容，還為將其開發(fā)成為免疫抑制藥物提供了試驗(yàn)依據(jù)，故具有重要的臨床應(yīng)用和社會經(jīng)濟(jì)意義，但其具體機(jī)制有待進(jìn)一步的研究。

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