彭忠田，譚德明，黃順玲，朱平安，3，劉菲（.中南大學(xué)湘雅醫(yī)院，長(zhǎng)沙市 40008；2.南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院，衡陽(yáng)市 4200；3.深圳市第七人民醫(yī)院，深圳市 5808）

乙型肝炎免疫球蛋白（Hepatitis B immunoglobulin，HBIG）是針對(duì)乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）的特異性被動(dòng)免疫制劑，其治療作用機(jī)制被認(rèn)為是與血循環(huán)中乙型肝炎表面抗原（HBsAg）特異性結(jié)合及中和HBV。而最近有研究[1～3]報(bào)道HBIG在體外細(xì)胞模型中能減少HBV的分泌或干擾包含HBV DNA中間體的核衣殼的包封。但慢性乙型肝炎患者體內(nèi)HBsAg含量豐富，一般劑量的HBIG很快與循環(huán)中的HB-sAg結(jié)合，真正能進(jìn)入肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的量不足以抑制HBV，使HBIG的不能發(fā)揮應(yīng)有的療效。納米粒是一種新型的藥物載體，藥物可通過(guò)溶解、包裹或吸附作用與納米粒結(jié)合。已有研究表明，藥物與納米粒結(jié)合后，跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)能力提高且藥效增強(qiáng)[4～6]。本研究選用人正常肝細(xì)胞株QSG7701細(xì)胞為體外細(xì)胞模型，對(duì)HBIG聚氰基丙烯酸正丁酯納米粒（Hepatitis B Immunoglobulin Polybutylcyano-Acrylate Nanoparticle，HBIGPBCA-NP）的細(xì)胞滲透情況進(jìn)行研究，以探討藥物經(jīng)納米化是否會(huì)提高HBIG的細(xì)胞滲透率，使進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)HBIG的濃度增加。

1 材料

1.1 儀器

全自動(dòng)紫外分光光度計(jì)（美國(guó)Beckman公司）；iCycler熒光實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）儀（美國(guó)BIO-RAD公司）；ANYTEST 2000時(shí)間分辨熒光測(cè)定儀（上海新波生物技術(shù)有限公司）；超凈工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；恒溫CO2培養(yǎng)箱（美國(guó)Quene公司）；IX70倒置顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.2 試藥

HBIG注射劑（四川遠(yuǎn)大蜀陽(yáng)藥業(yè)有限公司，批號(hào)：20050704，規(guī)格：100 IU·mL－1）；HBIG-PBCA-NP（中南大學(xué)湘雅醫(yī)院傳染病研究所，批號(hào)：200508，規(guī)格：6.0 IU·g－1）；達(dá)爾伯克氏改良伊格爾培養(yǎng)基（DMEM，批號(hào)：SH3002201）、胎牛血清（FBS，批號(hào)：16000-044）均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；乙型肝炎表面抗體（Hepatitis B surface antibody，HBsAb）定量檢測(cè)試劑盒（蘇州新波生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：20040610）；HBV核酸擴(kuò)增熒光檢測(cè)試劑盒（上海申友生物技術(shù)有限責(zé)任公司，批號(hào)：20050302）；MTT（批號(hào)：M-0793）、二甲基亞砜（DMSO，批號(hào)：D-0231）均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

1.3 細(xì)胞株及培養(yǎng)

QSG7701細(xì)胞株由中南大學(xué)湘雅醫(yī)院傳染病研究所保存。將QSG7701細(xì)胞接種于25 cm2培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，每瓶加入5～10 mL DMEM混合培養(yǎng)液（含10%FBS），置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育，每3～4 d以消化液消化傳代，細(xì)胞每2～3 d換液1次。

2 方法

2.1 細(xì)胞毒性試驗(yàn)

采用MTT比色試驗(yàn)法。用含10%FBS的DMEM將QSG7701細(xì)胞配制成單個(gè)細(xì)胞懸液，以每1 cm21.5×104個(gè)接種于96孔培養(yǎng)板上，每孔體積200 μL。試驗(yàn)分8組：HBIG低、中、高濃度（0.1、0.2、0.4 IU·mL－1）組，HBIG-PBCA-NP低、中、高濃度（0.1、0.2、0.4 IU·mL－1）組，對(duì)照組（加細(xì)胞及10%FBS的DMEM培養(yǎng)基）和空白孔（不加細(xì)胞，只加10%FBS的DMEM培養(yǎng)基），每組設(shè)5孔。放至37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中，分別于培養(yǎng)24 h及72 h后每孔加入5 mg·mL－1MTT溶液20 μL，37℃繼續(xù)孵育4 h后，吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)基，每孔加入DMSO 150 μL，振蕩10 min，在酶標(biāo)儀上選擇490 nm波長(zhǎng)，以空白孔調(diào)零，測(cè)定各孔吸光度值。

2.2 HBIG及HBIG-PBCA-NP體外跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)作用研究[5]

用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基將QSG7701細(xì)胞配成單細(xì)胞懸液，以每1 cm23×105個(gè)接種于12孔培養(yǎng)板中，24 h后待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)進(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)分7組：HBIG低、中、高濃度（0.1、0.2、0.4 IU·mL－1）組、HBIG-PBCA-NP低、中、高濃度（0.1、0.2、0.4 IU·mL－1）組、對(duì)照組（10%FBS的DMEM培養(yǎng)基），每組設(shè)5孔；與細(xì)胞共孵育，分別于加藥后培養(yǎng)2、4、8、16、24、48 h，小心吸取孔內(nèi)培養(yǎng)上清液（保存于－20℃），待測(cè)HBsAb定量（預(yù)試驗(yàn)時(shí)，另設(shè)含0.1、1.0 IU·mL－1HBIG及HBIG-PBCA-NP的10%FBS DMEM培養(yǎng)基組，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24、48 h，以觀察細(xì)胞培養(yǎng)條件下HBIG及HBIG-PBCA-NP的穩(wěn)定性）。

通過(guò)下列方法計(jì)算細(xì)胞內(nèi)HBIG濃度和HBIG滲透率：細(xì)胞內(nèi)HBIG濃度＝藥物終濃度－培養(yǎng)上清液濃度；HBIG滲透率＝（細(xì)胞內(nèi)藥物濃度/藥物終濃度）×100%。

采用時(shí)間分辨免疫熒光分析法進(jìn)行HBsAb定量檢測(cè)以計(jì)算HBIG濃度。按照試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行。取試劑盒中所附的陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照、參考標(biāo)準(zhǔn)品及待檢測(cè)樣品[即“2.2”項(xiàng)中（保存于－20℃）培養(yǎng)上清液]各100 μL，按順序加入微孔反應(yīng)條中并加貼封片；室溫下，振蕩儀緩慢振搖孵育1 h；洗板4次，拍干；每孔加入100 μL銪標(biāo)記物工作液，并加貼封片；室溫下，振蕩儀緩慢振搖孵育1 h；洗板6次，拍干；每孔加入試劑盒中所附的增強(qiáng)液100 μL，并加貼封片；室溫下，振蕩儀緩慢振搖孵育5 min；用時(shí)間分辨熒光測(cè)定儀測(cè)定HBsAb濃度值，并轉(zhuǎn)化為HBIG濃度。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 細(xì)胞毒性試驗(yàn)結(jié)果

各組吸光度值結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 各組吸光度值比較Tab 1 Comparison of absorbance value in each group

由表1可見(jiàn)，各試驗(yàn)組之間以及試驗(yàn)組與對(duì)照組之間吸光度值均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），表明所用藥物在本試驗(yàn)濃度下無(wú)細(xì)胞毒性作用。

3.2 HBIG及HBIG-PBCA-NP體外跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)作用結(jié)果

預(yù)試驗(yàn)研究表明，含0.1、1.0 IU·mL－1HBIG及HBIG-PBCA-NP的DMEM培養(yǎng)基置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24、48 h后，HBIG濃度與相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)濃度（即100 IU·mL－1的HBIG配制的0.1、1.0 IU·mL－1HBIG，6.0 IU·g－1的HBIG-PBCA-NP配制的0.1、1.0 IU·mL－1的HBIG-PBCA-NP）比較無(wú)顯著性差異（P＞0.05），表明HBIG及HBIG-PBCA-NP穩(wěn)定性好。

在不同時(shí)間點(diǎn)，各組細(xì)胞內(nèi)HBIG濃度測(cè)定值見(jiàn)表2，各組 HBIG滲透率見(jiàn)圖1。

表2 各組不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞內(nèi)HBIG濃度（IU·mL－1）Tab 2 Intracellular HBIG concentration of cells in each group at different time（IU·mL－1）

圖1 各組不同時(shí)間點(diǎn)HBIG的滲透率（%%）Fig 1 The penetrability ratio of HBIG in each group at different time（%%）

由表2可知，細(xì)胞培養(yǎng)液中所加藥物終濃度分別為0.1、0.2、0.4 IU·mL－1時(shí)，HBIG組和HBIG-PBCA-NP組細(xì)胞內(nèi)的HBIG濃度均隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，至24 h時(shí)已基本達(dá)最大值；HBIG組HBIG的胞內(nèi)濃度盡管隨著胞外藥物濃度的增加、培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而有所提高，但與HBIG-PBCA-NP組相比，后組升高更為明顯，且后組HBIG的胞內(nèi)濃度在各時(shí)間點(diǎn)均明顯高于前組。至24 h時(shí)，HBIG-PBCA-NP組HBIG的胞內(nèi)濃度約為HBIG組HBIG的胞內(nèi)濃度的1.5倍。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，2組之間比較具有顯著性差異（P＜0.05）。

由圖1可知，HBIG-PBCA-NP組HBIG滲透率均明顯高于HBIG組，兩兩相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

4 討論

研究[7]表明，IgG能通過(guò)體外跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)作用跨越不同物種的上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞屏障。QSG7701細(xì)胞是人正常肝細(xì)胞株，以上皮樣細(xì)胞為主，因此本試驗(yàn)以此細(xì)胞株為模型研究HBIG的體外跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)作用。

MTT結(jié)果表明，HBIG及HBIG-PBCA-NP無(wú)明顯細(xì)胞毒性作用，不影響試驗(yàn)研究。高、中、低濃度的HBIG及HBIGPBCA-NP跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)研究結(jié)果證明：納米化能增強(qiáng)HBIG的細(xì)胞內(nèi)滲透能力，提高HBIG的滲透率和細(xì)胞內(nèi)濃度，使進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的HBIG的量增加。納米化后細(xì)胞內(nèi)的HBIG濃度約是未納米化的1.5倍，這為HBIG更有效地進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)、減少HBV的分泌或干擾包含HBV DNA中間體的核衣殼的包封創(chuàng)造了良好的條件。但在動(dòng)物細(xì)胞模型中納米化的HBIG是否仍有上述作用，值得深入研究。

HBIG納米粒較HBIG更容易跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)入肝細(xì)胞內(nèi)的機(jī)制主要與肝細(xì)胞系的內(nèi)攝納米粒作用有關(guān)。目前普遍接受的觀點(diǎn)是納米載體可攜帶大分子藥物，通過(guò)內(nèi)吞途徑進(jìn)入細(xì)胞，完成對(duì)吸收性上皮細(xì)胞的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)。藥物納米化后肝細(xì)胞跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)能力增強(qiáng)的機(jī)制目前尚不十分清楚，主要有如下解釋：（1）納米粒通過(guò)細(xì)胞內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞；（2）納米粒被細(xì)胞膜吸附，黏附于細(xì)胞膜上，造成局部藥物濃度過(guò)高而產(chǎn)生濃度梯度，有利于藥物由胞外向胞內(nèi)擴(kuò)散；（3）藥物可與載體形成離子對(duì)，有利于藥物的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)；（4）載藥納米?？梢愿淖兡み\(yùn)轉(zhuǎn)機(jī)制，增加藥物對(duì)生物膜的透過(guò)性，有利于細(xì)胞內(nèi)藥效發(fā)揮[8]。

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