黃仕孫，王艷寧，高桂娥，余莉玲，吳曙粵#，張濤，岑淑姬，陳學(xué)松

（1.南寧市第一人民醫(yī)院，南寧市 530022；2.廣西梧州市食品藥品檢驗(yàn)所，梧州市 543002）

中藥退黃外洗液由大黃、茵陳、梔子、柴胡、郁金、薄荷腦等16味中藥組成，具有行氣解郁、舒肝理氣、利膽退黃等功效。經(jīng)多年的臨床使用證明，其退黃作用優(yōu)于口服或注射用中藥退黃制劑，性價(jià)比高[1]。本品經(jīng)皮膚給藥達(dá)到退黃作用，克服了新生兒口服藥物的困難，且未見毒副作用，對(duì)皮膚黏膜無(wú)刺激性[2]、無(wú)過(guò)敏反應(yīng)[3]，易于患兒接受治療。為了有效地控制產(chǎn)品質(zhì)量，筆者采用薄層色譜（TLC）對(duì)制劑中的大黃、薄荷腦進(jìn)行定性鑒別，用高效液相色譜（HPLC）法對(duì)制劑中的梔子苷進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果表明該方法操作簡(jiǎn)單、專屬性和重復(fù)性良好，可作為該藥的質(zhì)量控制依據(jù)。

1 儀器與試藥

LC-2010型HPLC儀（日本島津公司）；AE240S型電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；硅膠H、硅膠G薄層板（安徽霍山硅源材料廠）。

大黃對(duì)照藥材（批號(hào)：902-9002）、薄荷腦對(duì)照品（批號(hào)：0728-9304）、梔子苷對(duì)照品（批號(hào)：110749-200613）均由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供；中藥退黃外洗液（批號(hào)：081125、081115、081127）以及缺大黃的陰性樣品、缺薄荷腦的陰性樣品、缺梔子的陰性樣品均由南寧市第一人民醫(yī)院制劑室提供；乙腈、甲醇為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

2 定性鑒別

2.1 大黃的TLC鑒別

取本品10 mL，用乙醚振搖提取2次，每次20 mL，合并乙醚液，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液；取缺大黃的陰性樣品，同法制成陰性對(duì)照溶液；另取大黃對(duì)照藥材0.1 g，加甲醇20 mL，浸泡1 h，濾過(guò)，取濾液5 mL，蒸干，殘?jiān)铀?0 mL使溶解，再加鹽酸1 mL，加熱回流30 min，冷卻，用乙醚分2次提取，每次20 mL，合并乙醚液，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為對(duì)照藥材溶液。按照TLC法[4]試驗(yàn)，吸取上述3種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠H薄層板上，以石油醚（30～60℃）-甲酸乙酯-甲酸（15∶5∶1）的上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，置氨蒸汽中熏。結(jié)果，供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)；陰性對(duì)照無(wú)干擾。大黃的TLC見圖1。

圖1 大黃的TLCFig 1 TLC of Rheum officinale

2.2 薄荷腦的TLC鑒別

取本品10 mL，置具塞錐形瓶中，加乙醚10 mL，振搖數(shù)分鐘，靜置分層，分取乙醚層，濃縮至2.5 mL，作為供試品溶液；取缺薄荷腦的陰性樣品，同法制成陰性對(duì)照溶液；另取薄荷腦對(duì)照品，加乙醚制成每1 mL含2 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。吸取上述3種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-醋酸乙酯（17∶3）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%香草醛硫酸溶液，加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。結(jié)果，供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)；陰性對(duì)照無(wú)干擾。薄荷腦的TLC見圖2。

圖2 薄荷腦的TLCFig 2 TLC of Mentholum

3 含量測(cè)定

3.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-水（25∶75）；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：35℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：238 nm；進(jìn)樣量：10 μL。理論塔板數(shù)按梔子苷峰計(jì)算應(yīng)不低于2000，梔子苷與其相鄰峰均能達(dá)到基線分離，分離度R＞1.5。色譜見圖3。

圖3 高效液相色譜圖A.梔子苷對(duì)照品；B.供試品；C.陰性對(duì)照Fig 3 HPLC chromatogramsA.jasminoidin control；B.test sample；C.negative control

3.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取梔子苷對(duì)照品13.65 mg，置50 mL量瓶中，加甲醇定容，制成濃度為0.273 mg·mL-1的對(duì)照品溶液。

3.3 供試品溶液的制備

精密量取中藥退黃外洗液2 mL，置100 mL量瓶中，加甲醇定容，搖勻，濾過(guò)，即得。

3.4 陰性對(duì)照溶液的制備

取缺梔子的陰性樣品，按“3.3”項(xiàng)下方法制成陰性對(duì)照溶液。

3.5 線性關(guān)系考察

精密量取梔子苷對(duì)照品溶液（0.273 mg·mL-1）0.2、0.5、1.0、2.0、3.0 mL，置于10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得每1 mL含梔子苷5.46、13.65、27.3、54.6、81.9 μg的對(duì)照品溶液，按“3.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣測(cè)定（進(jìn)樣量為10 μL），測(cè)定峰面積。以梔子苷對(duì)照品進(jìn)樣量（X）為橫坐標(biāo)，峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為Y＝15998.125X+11969.984（r＝0.9998）。結(jié)果表明，梔子苷進(jìn)樣濃度在5.46～81.9 μg·mL-1范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好線性關(guān)系。

3.6 精密度試驗(yàn)

吸取同一梔子苷對(duì)照品溶液（0.273 mg·mL-1），重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積。結(jié)果，RSD＝1.6%，表明儀器精密度良好。

3.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液（批號(hào)：081125）10 μL ，分別于0、1、2、5、12 h進(jìn)樣，測(cè)定峰面積。結(jié)果，RSD＝0.5%（n＝5），表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.8 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一樣品（批號(hào)：081125）6份，按“3.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，照“3.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定峰面積積分值并計(jì)算含量。結(jié)果，梔子苷的平均含量為0.96 mg·mL-1，RSD＝0.7%（n＝6），表明該法重復(fù)性良好。

3.9 加樣回收率試驗(yàn)

取已知梔子苷含量的同一批樣品（批號(hào)：081125）共6份，分別精密加入梔子苷對(duì)照品溶液2.8 mL（濃度為0.273 mg·mL-1），按“3.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“3.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab 1 Results of recovery test（n＝6）

3.10 樣品含量測(cè)定

取3批中藥退黃外洗液樣品，按“3.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“3.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算梔子苷含量。結(jié)果，3批樣品（批號(hào)分別為081125、081115、081127）中梔子苷的含量分別為 0.96、0.99、0.97 mg·mL-1，平均含量為 0.97 mg·mL-1。因此，可暫定本品以梔子苷為定量標(biāo)準(zhǔn)，即每1 mL含梔子苷（C17H24O10）計(jì)，不少于0.7 mg（0.97×70%≈0.7 mg）。

4 討論

本品中的大黃、茵陳、梔子、柴胡、郁金、薄荷腦等為主要成分，在TLC定性鑒別中，因茵陳、梔子、柴胡、郁金等斑點(diǎn)拖尾或不清晰，故不能作為定性指標(biāo)。而大黃及薄荷腦的TLC鑒別專屬性強(qiáng)、方法簡(jiǎn)單，可作為制劑定性鑒別的依據(jù)。另在供試品溶液的制備中，由于供試品的生產(chǎn)處方工藝[5]與對(duì)照藥材提取方法差不多，所以直接取藥液加乙醚提取即可。在大黃的鑒別中，參照2005年版《中國(guó)藥典》（一部）方法[4]，應(yīng)使用三氯甲烷溶解，而考慮到三氯甲烷毒性大，最后殘?jiān)褂眉状既芙?，也取得良好效果。在梔子苷的含量測(cè)定中，《中國(guó)藥典》以水-乙腈（85∶15）為流動(dòng)相，但考慮到乙腈毒性比甲醇要大得多，且價(jià)格也貴很多，故用甲醇替代，適當(dāng)調(diào)節(jié)流動(dòng)相比例，以甲醇-水（25∶75）作流動(dòng)相，也取得很好分離效果。

梔子在本制劑中為主要成分之一，故選擇梔子苷作為含量測(cè)定的指標(biāo)。本試驗(yàn)建立的含量測(cè)定方法簡(jiǎn)單、專屬性強(qiáng)、精密度和重復(fù)性高，同時(shí)穩(wěn)定性能好，回收率為98.38%，可作為本品的定量控制指標(biāo)。

[1]吳曙粵，王艷寧，王利民，等.3種方案干預(yù)治療新生兒黃疸的成本-效果分析[J].中國(guó)藥房，2008，19（35）：2721.

[2]黃仕孫，王艷寧，高桂娥，等.退黃外洗液皮膚給藥過(guò)敏性實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)藥房，2007，18（20）：2327.

[3]黃仕孫，高桂娥，吳曙粵，等.中藥退黃外洗液皮膚給藥刺激性試驗(yàn)[J].兒科藥學(xué)雜志，2008，14（1）：23.

[4]國(guó)家藥典委員會(huì)編.中華人民共和國(guó)藥典（一部）[S].2005年版.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：附錄31、17.

[5]高桂娥，吳曙粵，黃仕孫，等.新生兒退黃外洗液的制備及臨床療效觀察[J].中成藥，2006，28（11）：I0005.