王天山，黃璐，趙守永，陳忠，陳光英#

（1.海南省熱帶藥用植物化學(xué)重點實驗室/海南師范大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，?？谑?571158；2.海南師范大學(xué)生命科學(xué)院，?？谑?571158）

海南血桐（Macaranga hemsleyana）為大戟科Euphorbiaceae血桐屬Macaranga thou植物[1]。該屬植物普遍具有藥用價值，東南亞地區(qū)的當?shù)鼐用裼糜谕夥笾委煹秱羵?、潰瘍腫痛和癤子等；在我國海南島除東北部外其他地區(qū)均有分布，民間主要用于治療咳嗽、哮喘等疾病。對該屬植物的化學(xué)成分及生物活性的研究備受各國學(xué)者關(guān)注。根據(jù)報道，從該屬植物發(fā)現(xiàn)多種具有藥用價值的化合物和活性先導(dǎo)物[2，3]。

本文主要報道利用抑菌活性跟蹤尋找海南血酮葉子中有效的抑菌活性部位，再利用硅膠柱色譜法對有效部位進行分離純化得到有效抑菌活性的化學(xué)成分，經(jīng)現(xiàn)代波譜法結(jié)合理化性質(zhì)鑒定其優(yōu)勢抑菌活性化學(xué)成分為沒食子酸乙酯。沒食子酸乙酯是有效的抑菌活性成分，可以用于油脂抑氧化劑、食品添加劑，還可以用于某些藥品的合成中間體[2，3]。本試驗利用反相-高效液相色譜（RP-HPLC）法測定海南血桐葉子中沒食子酸乙酯的含量，建立了測定海南血桐葉子中沒食子酸乙酯含量的方法，采用此方法測定海南血桐葉子中沒食子酸乙酯含量為9.0995 mg·g-1。抑菌活性試驗結(jié)果表明，沒食子酸乙酯對細菌有明顯的抑制活性，而對霉菌則沒有表現(xiàn)出活性。

1 儀器與試藥

XT4型顯微熔點測定儀（溫度計未校正，北京科儀電子儀器廠）；Bruker AV-400型核磁共振（NMR）儀（瑞士Bruker公司）；TU-1901型雙光束紫外-可見分光光度（UV）計（北京普析通用儀器有限公司）；Nicolet Nexus 670 FT-IR型紅外光譜（IR）儀（美國Thermo公司）；N1001型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（日本EYELA公司）；薄層色譜（TLC）板與柱色譜硅膠（青島海洋化工廠）；高效液相色譜（HPLC）系統(tǒng)，包括UV230+紫外檢測器、P230p高壓恒流泵（雙泵）、EC2000色譜工作站（大連依利特公司）；CTO-10AS VP型柱溫箱（日本島津公司）；BT124S型電子天平（德國賽多利斯股份有限公司）；Human Bio Nex Power1000型超純水儀器（北京普析通用儀器有限責任公司）。

樣品采集于海南霸王嶺地區(qū)，由海南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院鐘瓊芯副教授鑒定為真品，標本貯藏于海南省熱帶藥用植物化學(xué)重點實驗室；沒食子酸乙酯標準品（含量：99%，上海君創(chuàng)生物科技有限公司）。

2 分離純化及結(jié)構(gòu)鑒定

2.1 試驗方法

將海南血桐藥材自然晾干，取葉子3.5 kg粉碎后得到粉末，用3×10 L乙醇（85%）加熱回流3 h，濃縮得乙醇粗浸膏；再將乙醇粗浸膏分散于800 mL水中，依次用石油醚（3×2 L）、乙酸乙酯（3×2 L）和正丁醇（3×2 L）萃取，得到石油醚提取浸膏150 g、乙酸乙酯提取浸膏282 g、正丁醇提取浸膏210 g。經(jīng)抑菌活性篩選后，反復(fù)常壓硅膠柱色譜從乙酸乙酯提取浸膏中分離得到抑菌活性化合物0.4 g。

2.2 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物為無色針狀晶體（石油醚/丙酮），熔點：151.5～152.5℃，用TLC法檢測噴濃H2SO4顯紫紅色。UV：λmax＝299 nm（logε＝2.705，0.11 mg·mL-1，CH3OH）。IR（KBr）：3451與3296 cm-1（羥基），1706與1315 cm-1（酯基），2976與1409 cm-1（乙基），2935與1385 cm-1（甲基），3050、1650、1620、1536與1470（苯環(huán)）；1H-NMR（400 MHz，CDCl3）δH（ppm）：1.23（3H，t，J＝7.6Hz，H-9），4.16（2H，q，J＝7.6 Hz，H-8），6.95（2H，s，H-2 和 H-6）；13C-NMR（100 MHz，CDCl3）δ C（ppm）：14.6（C-9），61.7（C-8），168.6（C-7），110.0（C-2 和 C-6），146.4（C-3和C-5）121.8（C-1），139.7（C-4）。該結(jié)果與文獻[4]報道的波譜數(shù)據(jù)一致，鑒定為沒食子酸乙酯。

3 含量測定

3.1 色譜條件

色譜柱：5C18-AR-Ⅱ（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈∶水（2%乙酸）＝（5∶95～10∶90，10 min）；流速：1 mL·min-1；柱溫：30 ℃；檢測波長：299 nm；進樣量：20 μL。色譜見圖1。

圖1 高效液相色譜圖A.對照品；B.供試品Fig 1 HPLC chromatogramsA.reference substance；B.test sample；1.ethyl gallate

3.2 提取方法

將2 g海南血桐葉子置于250 mL碘量瓶中，加入50 mL 70%的乙醇溶液，在室溫下振蕩提取48 h，提取液用等體積石油醚和乙酸乙酯分別萃取3次，再將水溶液濃縮后用甲醇定容于50 mL容量瓶中。

3.3 標準品溶液的制備

精密稱取0.0040 g沒食子酸乙酯標準品，甲醇溶解后定容于10 mL容量瓶，制成濃度為0.4 mg·mL-1的母液；吸取5 mL 0.4 mg·mL-1的母液于10 mL容量瓶定容，制成0.2 mg·mL-1的溶液；吸取5 mL 0.2 mg·mL-1的溶液于10 mL容量瓶定容，制成0.1 mg·mL-1的溶液；吸取5 mL 0.1 mg·mL-1的溶液于10 mL容量瓶定容，制成0.05 mg·mL-1的溶液；吸取5 mL 0.05 mg·mL-1的溶液于10 mL 容量瓶定容，制成0.025 mg·mL-1的溶液。

3.4 標準曲線的制備

采用5倍定量環(huán)進樣法，將以上對半稀釋標準品溶液近上述RP-HPLC條件測定，獲得的標準品溶液進樣量（X）與對應(yīng)峰面積積分值（Y）制備標準曲線。由標準曲線得出回歸方程為Y＝29167925X－154.6（r＝0.9999）。

3.5 精密度試驗

吸取0.4 mg·mL-1的標準品溶液適量，以5倍定量環(huán)進樣20 μ L，連續(xù)平行進樣6次。結(jié)果，平均峰面積積分值為11484.89，RSD＝0.83%，表明儀器精密度良好。

3.6 穩(wěn)定性試驗

稱取2.0131 g海南血桐葉子，利用以上優(yōu)化的提取方法得到待測樣品，用甲醇定容于50 mL容量瓶，5倍定量環(huán)進樣20 μL進行RP-HPLC分析。其穩(wěn)定性考察時間為0、1、3、5、8、12 h，共進樣6次。結(jié)果，平均峰面積積分值為10519.55，RSD＝0.61%，表明樣品在考察時間內(nèi)沒食子酸乙酯穩(wěn)定性良好。

3.7 重現(xiàn)性試驗

分別稱取2 g海南血桐葉子6份，利用以上優(yōu)化的提取方法得到待測樣品，用甲醇定容于50 mL容量瓶，5倍定量環(huán)進樣20 μL進行RP-HPLC分析。結(jié)果，平均峰面積積分值為10517.49，RSD＝0.40%，表明方法重現(xiàn)性良好。

3.8 含量測定

分別精確稱取2.0073、2.0102、2.0047 g海南血桐葉子，利用以上優(yōu)化的提取方法得到待測樣品，分別用甲醇定容于50 mL容量瓶，5倍定量環(huán)進樣20 μL進行HPLC分析，每一批樣品平行測定5次后取平均值。結(jié)果，平均峰面積積分值為10499.18，根據(jù)回歸方程計算出葉子中沒食子酸乙酯的含量為 9.0995 mg·g-1。

4 抑菌活性研究

沒食子酸乙酯是一種有效的抑菌活性成分，對金黃色葡萄球菌、白葡萄球菌和變形桿菌具有較強的抑制作用[2，3]。本文根據(jù)抑菌活性篩選，從海南血桐葉子乙酸乙酯提取浸膏中分離得到抑菌活性成分亦為沒食子酸乙酯，并測定其對細菌和霉菌的最小抑制濃度。微生物抑制活性試驗結(jié)果表明，沒食子酸乙酯對細菌有明顯的抑制活性，其對大腸桿菌、枯草桿菌和金黃色葡萄球菌的最小抑制濃度分別為0.075、0.075、0.1 mg·mL-1；而對毛霉、黑曲霉等霉菌則沒有抑制活性。

5 討論

5.1 檢測波長的選擇

精密稱取0.0010 g標準品，甲醇溶解，定容于50 mL容量瓶，制成含量為0.02 mg·mL-1的待測溶液，進行200～900 nm全波長掃描，測得最大吸收波長為299 nm。因此，選擇299 nm作為RP-HPLC檢測波長。

5.2 流動相的優(yōu)化

根據(jù)文獻報道，分離欒樹枝葉中沒食子酸乙酯的RP-HPLC條件為甲醇∶水（0.05 mol·L-1乙酸）＝（10∶90～30∶70，15 min），流速1 mL·min-1[5]；分離16種槭屬植物葉中沒食子酸甲酯的HPLC條件為乙腈∶水（2.5%乙酸）＝10∶90，流速1 mL·min-1[6]。本試驗對以上2種分離條件進行優(yōu)化，得到分離海南血桐葉子中沒食子酸乙酯的最佳色譜條件為乙腈∶水（2%乙酸）＝（5∶95～10∶90，10 min），流速為1 mL·min-1，柱溫30℃。

5.3 提取方法的優(yōu)化

試驗比較了超聲提取法、回流提取法、振蕩提取法和冷浸提取法4種方法對同量樣品中沒食子酸乙酯的提取率。結(jié)果表明，振蕩法提取出來的沒食子酸乙酯明顯高于其他3種方法，因此選擇振蕩提取法。

5.4 提取溶液的優(yōu)化

根據(jù)文獻[5，6]報道，提取中藥材中沒食子酸及其衍生物選用的最佳溶劑為乙醇溶液。因此，對海南血桐中沒食子酸乙酯選擇不同濃度的乙醇溶液進行提取，并對其進行優(yōu)化。分別設(shè)定乙醇濃度為0、10%、30%、50%、70%、90%和100%，利用最佳振蕩提取法室溫振蕩提取48 h，再對各自樣品進行RP-HPLC分析，選擇峰面積最高者作為最佳提取溶液。結(jié)果表明，利用70%乙醇溶液提取所得的沒食子酸含量最高。

綜上分析，提取分離海南血桐葉子中沒食子酸乙酯的條件是在室溫下振蕩提取48 h，所得提取浸液分別用石油醚和乙酸乙酯萃取后定容于50 mL容量瓶中。其HPLC色譜條件為乙腈∶水（2%乙酸）＝（5∶95～10∶90，10 min），流速為1 mL·min-1，柱溫為30 ℃。

[1]中國科學(xué)院華南植物研究所編.廣東植物志（第五卷）[M].廣州：廣東科技出版社，2003：83.

[2]Martin AS，Erdal B，Ngeh JT，et al.Antifungal clerodane diterpenes from Macaranga monandra（L）Muell.et Arg.（Euphorbiaceae）[J].J Agric Food Chem，2003，51（26）：7606.

[3]馬廣恩，申雅維，魯學(xué)照，等.欒樹抗菌有效成分的研究[J].中草藥，1998，29（2）：84.

[4]于志斌，楊廣義，吳 霞，等.救心草的化學(xué)成分研究[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2007，19（1）：67.

[5]申雅維，馬廣恩.欒樹枝葉中沒食子酸及甲酯、乙酯提取方法及含量測定[J].中草藥，1998，29（3）：165.

[6]高春春，趙文華，宋學(xué)英，等.16種槭屬植物葉中沒食子酸甲酯的含量[J].中藥材，2006，29（12）：1281.