王榮紅，俞 嘉，熊志立，李 寧，王 姝，李發(fā)美

（沈陽(yáng)藥科大學(xué)藥學(xué)院，沈陽(yáng)市 110016）

得生丸收載于2005年版《中國(guó)藥典》（一部），處方由益母草、當(dāng)歸、白芍、柴胡、川芎、木香6味藥材組成，具有養(yǎng)血化瘀、舒肝調(diào)經(jīng)之功效，臨床上廣泛用于治療氣滯血瘀所致的月經(jīng)不調(diào)、痛經(jīng)。原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[1]中，除顯微鑒別外，只對(duì)方中白芍進(jìn)行了薄層色譜（TLC）鑒別，無(wú)含量控制方法。另有文獻(xiàn)[2，3]報(bào)道采用高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定得生丸中芍藥苷的含量。為了保證本品用藥的安全性、合理性，本研究在原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)方中藥材所含主要成分的文獻(xiàn)資料[4]，增加了益母草、柴胡和木香的TLC鑒別，采用HPLC法對(duì)芍藥苷進(jìn)行含量測(cè)定。

1 儀器與試藥

HPLC儀系統(tǒng)（日本島津公司）；AL104型電子天平（瑞士Mettler Toledo公司）；硅膠G（青島海洋化工廠）。

得生丸（邯鄲制藥有限公司，批號(hào)：1001、1002、1003；承德頸復(fù)康藥業(yè)集團(tuán)有限公司，批號(hào)：070301）；芍藥苷對(duì)照品（批號(hào)：110736-200732）、鹽酸水蘇堿對(duì)照品（批號(hào)：110712-200508）、白芍對(duì)照藥材（批號(hào)：120905-200508）、益母草對(duì)照藥材（批號(hào)：120912-200507）、柴胡對(duì)照藥材（批號(hào)：120992-200705）、木香對(duì)照藥材（批號(hào)：120921-200506）均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所；乙腈為色譜純，水為重蒸水，其余試劑均為分析純。

2 定性鑒別

2.1 益母草的TLC鑒別

取本品18 g，加硅藻土7 g，研勻，加0.1 mol·L-1鹽酸溶液60 mL，水浴加熱回流1 h，冷卻，3500 r·min-1離心10 min，濾過(guò)，濾液加入新鮮配制的2%雷氏鹽溶液20 mL，放置冰箱（4℃左右）中過(guò)夜，移至離心管中，3500 r·min-1離心10 min，棄去上清液，殘?jiān)颖? mL溶解，濾過(guò)，濾液作為供試品溶液；另取益母草對(duì)照藥材1.5 g，同法制成對(duì)照藥材溶液；另取鹽酸水蘇堿對(duì)照品，加無(wú)水乙醇制成2 mg·mL-1的對(duì)照品溶液。分別吸取上述3種溶液各2 μL，點(diǎn)于同一硅膠G板上，以無(wú)水乙醇-丙酮-甲酸-0.5 mol·L-1鹽酸（4∶10∶0.5∶1）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以碘化鉍鉀-碘化鉀碘溶液（1∶1），日光下檢視。結(jié)果，供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜和對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的紫紅色斑點(diǎn)；陰性對(duì)照無(wú)干擾。益母草的TLC見(jiàn)圖1。

圖1 益母草的TLC1.陰性對(duì)照；2.鹽酸水蘇堿對(duì)照品；3.益母草對(duì)照藥材；4～7.供試品Fig 1 TLC of Leonurus japonicus1.negative control；2.stachydrine hydrochloride reference substance；3.Herba Leonuri；4～7.test samples

2.2 柴胡的TLC鑒別

取本品18 g，加硅藻土7 g，研勻，加乙醇60 mL，加熱回流30 min，放冷，濾過(guò)，濾液置水浴上蒸干，殘?jiān)铀?0 mL使溶解，移至分液漏斗中，用乙醚振搖提取3次，每次20 mL，分取水層，揮去殘留乙醚，用水飽和正丁醇振搖提取3次，每次20 mL，合并正丁醇提取液，用等體積氨試液洗滌，取正丁醇液，用正丁醇飽和的水洗滌3次，每次20 mL，取正丁醇液，水浴上蒸干，殘?jiān)訜o(wú)水乙醇1 mL使溶解，作為供試品溶液；另取柴胡對(duì)照藥材0.5 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。分別吸取上述 2種溶液各3 μL，點(diǎn)于同一硅膠G板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水（15∶40∶22∶10）10℃以下分層的下層溶液為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以2%對(duì)二甲氨基苯甲醛的10%硫酸乙醇溶液，105℃加熱數(shù)分鐘，紫外光燈（365 nm）下檢視。結(jié)果，供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)；陰性對(duì)照無(wú)干擾。柴胡的TLC見(jiàn)圖2。

圖2 柴胡的TLC1.陰性對(duì)照；2.柴胡對(duì)照藥材；3～6.供試品Fig 2 TLC of Bupleurum chinense1.negative control；2.Radix Bupleuri；3～6.test sample

2.3 木香的TLC鑒別

取本品18 g，加硅藻土7 g，研勻，置圓底燒瓶中，加水200 mL，照揮發(fā)油測(cè)定法[1]測(cè)定，自測(cè)定器上端加入乙酸乙酯2 mL，加熱并保持微沸2 h，放冷，取乙酸乙酯層作為供試品溶液；另取木香對(duì)照藥材0.5 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。分別吸取上述2種溶液各3 μL，點(diǎn)于同一硅膠G板上，以正己烷-乙酸乙酯（6∶1）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，105℃加熱數(shù)分鐘，日光下檢視。結(jié)果，供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)；陰性對(duì)照無(wú)干擾。木香的TLC見(jiàn)圖3。

圖3 木香的TLC1.木香對(duì)照藥材；2.供試品；3.陰性對(duì)照Fig 3 TLC ofAucklandia lappa1.RadixAucklandiae；2.test samples；3.negative control

3 含量測(cè)定

3.1 對(duì)照品溶液的制備

取芍藥苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成12 μg·mL-1的對(duì)照品溶液，即得。

3.2 供試品溶液的制備

取重量差異項(xiàng)下的得生丸樣品18 g，精密稱定，再精密加入硅藻土7 g，研勻，取1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶?jī)?nèi)，加入30%甲醇溶液25 mL，密塞，超聲提取30 min，放冷，濾過(guò)，用30%甲醇洗滌容器數(shù)次，合并濾液和洗滌液，轉(zhuǎn)移至50 mL量瓶中，加30%甲醇至刻度，搖勻，濾過(guò)，即得供試品溶液。

3.3 陰性對(duì)照溶液的制備

除白芍以外，其余各藥按處方與制法制成陰性樣品，再按“3.2”項(xiàng)下方法制成陰性對(duì)照溶液。

3.4 色譜條件與色譜系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈-水（18∶82）；流速：1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：230 nm；柱溫：室溫；進(jìn)樣量：20μL。理論塔板數(shù)按芍藥苷峰計(jì)算應(yīng)不低于2000。在該色譜條件下，取對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性對(duì)照溶液各20μL進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果表明，樣品中其它成分對(duì)芍藥苷的測(cè)定無(wú)干擾。色譜見(jiàn)圖4。

圖4 高效液相色譜圖A.芍藥苷對(duì)照品；B.陰性對(duì)照；C.供試品Fig 4 HPLC chromatogramsA.paeoniflorin control；B.negative control；C.test sample

3.5 線性關(guān)系考察

精密吸取濃度為1.40、5.60、11.2、16.8、22.4、28.0 μg·mL-1的對(duì)照品溶液各20μL，按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。以濃度（X）為橫坐標(biāo)，峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為Y＝2.00×107X－1.27×103（r＝0.9990）。結(jié)果表明，芍藥苷的檢測(cè)濃度在1.40～28.0μg·mL-1范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好線性關(guān)系。

3.6 精密度試驗(yàn)

3.6.1 儀器精密度試驗(yàn) 精密吸取同一濃度對(duì)照品溶液20μL，按上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果，RSD＝0.75%，表明儀器精密度良好。

3.6.2 中間精密度試驗(yàn) 取同一批號(hào)供試品溶液，分別連續(xù)3 d使用3臺(tái)不同的HPLC儀，按上述色譜條件測(cè)定峰面積。結(jié)果，RSD＝0.4%，表明本法的中間精密度良好。

3.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液，分別于0、2、4、8、10、12 h按上述色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定峰面積。結(jié)果，RSD＝1.4%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.8 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批樣品，按“3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，平行操作6次，測(cè)定芍藥苷的含量。結(jié)果，樣品平均含量為0.979 mg·g-1，RSD＝1.0%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

3.9 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量的同一批樣品6份，每份約0.5 g，分別精密加入低、中、高（50%、100%、150%）濃度的對(duì)照品溶液適量，按“3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，依法處理，測(cè)定其含量，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）Tab 1 Result of recovery tests（n＝9）

3.10 樣品含量測(cè)定

取4批樣品，按上述色譜條件和方法測(cè)定樣品，外標(biāo)法計(jì)算芍藥苷含量。結(jié)果，4批樣品含量分別為1.083、1.101、1.236、1.004 mg·g-1。

4 討論

木香的TLC鑒別中，曾選用乙醚、乙酸乙酯作為提取溶劑，但TLC圖中陰性干擾嚴(yán)重；后改用揮發(fā)油測(cè)定法提取處方中揮發(fā)性成分，可去除干擾。柴胡TLC鑒別的展開(kāi)劑考察了三氯甲烷-甲醇-水（13∶7∶2）10℃以下放置的下層溶液和三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水（15∶40∶22∶10）10 ℃以下分層的下層溶液。結(jié)果表明，后者作為展開(kāi)劑時(shí)，待測(cè)成分斑點(diǎn)比移值合適，分離度較好，且陰性對(duì)照無(wú)干擾。

在芍藥苷的含量測(cè)定過(guò)程中，考察了乙腈-水（18∶82）、乙腈-0.07%磷酸水（18∶82）等流動(dòng)相。結(jié)果表明，以乙腈-水（18∶82）作為流動(dòng)相時(shí)，分離效果、峰形較好。研究過(guò)程中還考察了稀乙醇[2]、30%甲醇等提取溶劑，結(jié)果表明30%甲醇提取效率高，故采用30%甲醇為提取溶劑。

[1]國(guó)家藥典委員會(huì)編.中華人民共和國(guó)藥典（一部）[S].2005年版.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：603、附錄57.

[2]陳華國(guó)，陳 慶，周 欣，等.HPLC法測(cè)定婦科得生丸中芍藥苷的含量[J].貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2007，29（5）：70.

[3]張文清，葉 華，張怡評(píng).腎寧片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J].中國(guó)藥房，2008，19（30）：2366

[4]嚴(yán)優(yōu)芍，李衛(wèi)民，高 英，等.HPLC法測(cè)定益母草不同制劑中水蘇堿[J].中草藥，2006，37（1）：70.