殷丹，陳科力

（湖北中醫(yī)學(xué)院省部共建中藥資源和中藥復(fù)方教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢市 430065）

江南卷柏又名地柏枝，為卷柏科植物江南卷柏Selaginella moelledorfii Hieron的全草，具有涼血止血、清熱利濕的功效，民間用來治療肝炎、各種內(nèi)外出血等疾病?！稄V西中藥材標(biāo)準(zhǔn)》將其作為石上柏的原植物之一收載，用于癌癥及多種炎癥的治療[1]。江南卷柏含有黃酮類、木脂素類、有機(jī)酸類、酚類、糖類等化學(xué)成分，其中以黃酮類成分的研究較為深入。筆者研究發(fā)現(xiàn)，江南卷柏抑制黃嘌呤氧化酶、脂氧化酶[2]和抗腫瘤的有效部位主要是總黃酮部位。因此，本研究以總黃酮和浸膏得率為考察指標(biāo)，對(duì)江南卷柏總黃酮的最佳提取工藝進(jìn)行研究，并以紫外-分光光度法進(jìn)行總黃酮的含量測定。

1 材料

1.1 儀器

U-2001型紫外-分光光度計(jì)（日本Hitachi公司）；BP-211D型十萬分之一分析天平（德國Sartorius公司）。

1.2 試藥

江南卷柏的全草采集于湖北宜昌霧渡河，經(jīng)湖北中醫(yī)學(xué)院陳科力教授鑒定為真品；穗花杉雙黃酮標(biāo)準(zhǔn)品（省部共建中藥資源和中藥復(fù)方教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自制，HPLC測定質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞99.0%）；所用試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 總黃酮的含量測定

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備：精密稱取減壓干燥至恒重的穗花杉雙黃酮標(biāo)準(zhǔn)品適量，加甲醇超聲溶解并定容至25 mL容量瓶中，制成0.0172 mg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備：取江南卷柏藥材10 g，以溶劑提取，將提取液過濾合并后定容至1000 mL容量瓶中，精密移取1 mL，以甲醇定容至25 mL容量瓶中，備用。

2.1.3 檢測波長的確定：以甲醇作為試劑空白，照紫外-可見分光光度法，在200～500 nm波長范圍內(nèi)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品溶液和供試品溶液進(jìn)行掃描，結(jié)果表明兩者紫外吸收?qǐng)D譜類似，且在270 nm波長處均有最大吸收，故確定270 nm為檢測波長。

2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：分別精密移取穗花杉雙黃酮標(biāo)準(zhǔn)品溶液0、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL，置于10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度。照紫外-可見分光光度法，以相應(yīng)試劑為空白于270 nm波長處測定吸光度（A）。以吸光度（A）為縱坐標(biāo)，濃度（C）為橫坐標(biāo)，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為A＝86.744C－0.0015（r＝0.9994）。結(jié)果表明，標(biāo)準(zhǔn)品在0.00172～0.00602 mg·mL-1濃度范圍內(nèi)與吸光度呈良好線性關(guān)系。

2.1.5 精密度試驗(yàn)：取供試品溶液適量，按“2.1.4”項(xiàng)下方法重復(fù)進(jìn)行5次。結(jié)果，RSD＝0.6%，表明本方法精密度良好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)：取供試品溶液適量，按“2.1.4”項(xiàng)下方法，分別在0、2、4、6、8 h測定吸光度。結(jié)果，RSD＝1.7%，表明供試品在8 h內(nèi)測定基本穩(wěn)定。

2.1.7 重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批藥材，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1.4”項(xiàng)下方法測定吸光度，重復(fù)5次。結(jié)果，RSD＝2.3%，表明方法重復(fù)性良好。

2.1.8 加樣回收率試驗(yàn)：精密移取已知含量的供試品溶液6份各0.5 mL，分別精密加入穗花杉雙黃酮標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1.4”項(xiàng)下方法測定，結(jié)果見表1。

2.1.9 供試品的含量測定：取供試品溶液適量，按“2.1.4”項(xiàng)下方法于270 nm波長處測定吸光度，按回歸方程計(jì)算溶液中總黃酮的質(zhì)量濃度。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab 1 The results of recovery test

2.1.10 浸膏得率的測定：精密移取江南卷柏提取液200 mL，置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干后置烘箱內(nèi)105℃干燥3 h，取出，置干燥器內(nèi)，冷卻30 min，迅速精密稱定質(zhì)量后計(jì)算浸膏得率。

2.2 不同提取方法的提取效果比較

2.2.1 冷浸法：取江南卷柏藥材10 g，加15倍量75%乙醇室溫浸漬48 h，提取液過濾后定容至1000 mL容量瓶中。

2.2.2 滲漉法：取江南卷柏藥材10 g，先以少量75%乙醇浸泡1 h，使其充分溶脹后裝入滲漉筒中，并以醇液浸泡過夜，再加15倍量75%乙醇進(jìn)行滲漉，流速為1 mL·min-1，收集滲漉液并定容至1000 mL容量瓶中。

2.2.3 乙醇回流法：取江南卷柏藥材10 g，加15倍量75%乙醇回流提取2次，每次2 h，提取液過濾后合并，定容至1000 mL容量瓶中。

2.2.4 結(jié)果比較：上述溶液分別取1 mL定容至25 mL容量瓶中，于270 nm波長處測定吸光度，按回歸方程計(jì)算樣品溶液中總黃酮提取量，并測定浸膏得率。結(jié)果表明，乙醇回流法提取效果最佳。不同提取方法的結(jié)果比較見表2。

表2 不同提取方法的結(jié)果比較Tab 2 Comparison of result of different extraction methods

2.3 正交試驗(yàn)及其結(jié)果

采用正交試驗(yàn)法，以乙醇濃度（A）、提取時(shí)間（B）、提取次數(shù)（C）、乙醇用量（D）為4因素，各取3個(gè)水平，按照L9（34）正交表進(jìn)行乙醇回流提取試驗(yàn)，分別測定總黃酮的提取量和浸膏得率，作為考察指標(biāo)，并對(duì)此進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。結(jié)果表明，乙醇濃度對(duì)總黃酮提取量及浸膏得率影響較大，其次是提取時(shí)間，而提取次數(shù)和乙醇用量均無顯著性差異。結(jié)合節(jié)約成本方面綜合考慮，確定最佳組合是A2B1C1D1。因素水平見表3；正交試驗(yàn)結(jié)果見表4；方差分析結(jié)果見表5、表6。

表3 因素水平Tab 3 Factors and levels

表4 正交試驗(yàn)結(jié)果Tab4 Results of orthogonal experiment

表5 總黃酮提取量的方差分析結(jié)果Tab 5 Results of variance analysis of content of total flavonoids

表6 浸膏得率的方差分析結(jié)果Tab 6 Results of variance analysis of extracting rate

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)篩選得到的最佳工藝A2B1C1D1提取3次，進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，得總黃酮的提取量為0.1552 g，浸膏得率為8.91%（n＝3）。

3 討論

筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，江南卷柏中的黃酮類成分大部分為雙黃酮結(jié)構(gòu)，其主要含穗花杉雙黃酮，含量約占80%以上。本研究發(fā)現(xiàn)，采用傳統(tǒng)的以蘆丁為對(duì)照品、NaNO2-Al（NO3）3-NaOH為顯色系統(tǒng)測定總黃酮含量的方法并不適合測定江南卷柏中的總黃酮類成分，因其紫外吸收曲線與蘆丁的相差很大，測定的回收率較低，不足90%。故筆者直接以其主要黃酮成分穗花杉雙黃酮作為標(biāo)準(zhǔn)品，以確?？傸S酮含量測定方法的準(zhǔn)確性。

本研究優(yōu)選出江南卷柏總黃酮的最佳提取工藝條件為：用藥材9倍量85%乙醇，回流提取2次，每次1 h。同時(shí)，還建立了以紫外-分光光度法測定江南卷柏總黃酮含量的方法，可為控制藥材的質(zhì)量提供可靠的科學(xué)依據(jù)。

[1]廣西自治區(qū)衛(wèi)生廳.廣西中藥材標(biāo)準(zhǔn)[M].南寧：廣西科學(xué)技術(shù)出版社，1992：169.

[2]黎 莉，陳科力，方繼德，等.卷柏屬7種藥用植物的提取物抑制黃嘌呤氧化酶的活性研究[J].中藥材，2007，30（4）：445.