李文艷，楊佳，姚佳晨，錢忠直，畢開(kāi)順

（1.上海市浦東新區(qū)公利醫(yī)院藥劑科，上海市 200135；2.沈陽(yáng)藥科大學(xué)藥物分析教研室，沈陽(yáng)市 110016；3.國(guó)家藥典委員會(huì)，北京市 100061）

非洛地平（Felodipine）是第2代二氫吡啶類鈣離子拮抗藥，通過(guò)抑制小動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞外鈣的內(nèi)流，增加冠狀竇血流量，降低全身及冠狀動(dòng)脈血管阻力，使血壓下降，具有長(zhǎng)效、不良反應(yīng)少等優(yōu)點(diǎn)[1～3]，臨床上用于輕、中度高血壓的治療?，F(xiàn)筆者采用液-質(zhì)聯(lián)用法對(duì)非洛地平的血藥濃度進(jìn)行測(cè)定并研究其藥動(dòng)學(xué)，另監(jiān)測(cè)受試者在服藥后規(guī)定時(shí)間的動(dòng)脈血壓和心率（HR）等藥效指標(biāo)，研究非洛地平的體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)及藥效學(xué)過(guò)程的相關(guān)性。

1 材料

1.1 儀器

2010EV LC-MS聯(lián)用儀（日本島津公司）；CAY-1型液體快速混合器（北京長(zhǎng)安儀器廠）；WM-2H型無(wú)油壓縮機(jī)（天津醫(yī)療儀器廠）；TGL-16C離心機(jī)、TDL-40B離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；SK250H超聲儀（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）；TG-328A分析天平（上海天平儀器廠）；歐姆龍上臂式血壓計(jì)（日本歐姆龍株式會(huì)社）。

1.2 試藥

非洛地平片（北京協(xié)和藥廠，規(guī)格：每片10 mg，批號(hào)：H19980034，有效期：20100331）；非洛地平對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，純度：99.7%，有效期：2011年8月）；內(nèi)標(biāo)：尼莫地平對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，純度：99.8%，有效期：2011年5月）；甲醇為色譜純，乙醚、正己烷、氫氧化鈉為分析純，水為雙重蒸餾水。

2 方法

2.1 色譜及質(zhì)譜條件

色譜柱：Kromasil C18（150 mm×4.6 mm，5 μm），保護(hù)柱（大連中匯達(dá)公司）；流動(dòng)相：甲醇-0.1%甲酸（84∶16）；流速：0.8 mL·min－1；柱溫：30 ℃ 。離子源：電噴霧離子化（ESI）源；電噴霧離子化（CDL）溫度：250℃；加熱塊溫度：200℃；霧化氣（N2）流速：1.5 L·min－1；檢測(cè)電壓：1.6 kV；正離子方式檢測(cè)；掃描方式：選擇離子監(jiān)測(cè)（SIM）；用于定量分析的離子分別為m/z 406（非洛地平）和m/z 441（尼莫地平）。在選定的色譜條件下，血漿中非洛地平峰形良好，與內(nèi)源性雜質(zhì)分離完全。非洛地平和內(nèi)標(biāo)尼莫地平的保留時(shí)間分別為6.4、4.4 min。LC-MS色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 LC-MS色譜圖A.空白血漿；B.空白血漿+5 μg·L－1非洛地平對(duì)照品+內(nèi)標(biāo)；C.受試者服藥4 h后血漿樣品+內(nèi)標(biāo)；1.非洛地平；2.尼莫地平Fig 1 LC-MS chromatogramA.blank plasma；B.blank plasma+5 μg·L－1felodipine control+internal standard；C.plasma sample of 4 h after medication；1.filodipine；2.nimodipine

2.2 試驗(yàn)溶液的制備

準(zhǔn)確稱取非洛地平對(duì)照品適量，置于100 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，制備成相當(dāng)于非洛地平濃度為200 mg·L－1的貯備液。另準(zhǔn)確稱取尼莫地平對(duì)照品適量，置于100 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，制備成相當(dāng)于尼莫地平濃度為50 mg·L－1的貯備液，再稀釋成濃度為20 μg·L－1的內(nèi)標(biāo)溶液。

2.3 血漿樣品處理

取血漿500 μL，置于10 mL具塞試管中，依次加入內(nèi)標(biāo)溶液50 μL、1.0 mol·L－1NaOH溶液100 μL、乙醚-正己烷（4∶1）2.5 mL，渦旋混合3 min，4000 r·min－1離心5 min，取上清液置于另一試管中，空氣吹干，殘留物加甲醇100 μL溶解，超聲（58 kHz，250 W）1 min，渦旋1 min，12000 r·min－1離心3 min，取上清液20 μL進(jìn)樣分析。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

取空白血漿500 μL，加入非洛地平對(duì)照品貯備液適量，制備成相當(dāng)于非洛地平濃度為 0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 μg·L－1的模擬血漿樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法操作，進(jìn)樣分析，記錄色譜。以待測(cè)物濃度（C）為橫坐標(biāo)，待測(cè)物與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值（A）為縱坐標(biāo)，用加權(quán)（W＝1/X2）最小二乘法進(jìn)行回歸，得回歸方程為：A＝0.1940C+0.02935（r＝0.9948）。結(jié)果表明，非洛地平血藥濃度在0.2～20.0 μg·L－1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，定量下限為0.2 μg·L－1。

2.5 回收率及精密度試驗(yàn)

分別制備0.5、2.0、10.0 μg·L－13種濃度的模擬血漿樣品各6份，按“2.3”項(xiàng)下方法操作；另除不加系列對(duì)照品溶液和內(nèi)標(biāo)溶液外，其他按“2.3”項(xiàng)下方法操作，殘留物以相應(yīng)濃度的系列對(duì)照品溶液溶解，進(jìn)樣分析，以2種處理方法的峰面積比值計(jì)算提取回收率。3種濃度下平均提取回收率分別為81.9%、82.7%、88.9%，RSD分別為14.4%、11.5%、14.9%。另分別于同日內(nèi)連續(xù)測(cè)定5次及5 d內(nèi)每日測(cè)定1次，計(jì)算日內(nèi)和日間精密度，結(jié)果日內(nèi)、日間RSD均小于14.3%，符合人體藥動(dòng)學(xué)研究的要求。

2.6 藥動(dòng)學(xué)研究

2.6.1 受試者選擇：10名男性健康受試者，年齡（22±3）歲，體質(zhì)量（70±5）kg，身高170～175 cm。全面體格檢查結(jié)果良好，血、尿常規(guī)，肝、腎功能及心電、心率、血壓均在正常范圍內(nèi)。試驗(yàn)前14天及試驗(yàn)期間未服用其它任何藥物。試驗(yàn)期間禁煙酒。所有受試者在入組前均簽署知情同意書(shū)，該知情同意書(shū)和試驗(yàn)方案經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院倫理委員會(huì)討論批準(zhǔn)通過(guò)。

2.6.2 試驗(yàn)方案及血樣采集：10名受試者禁食12 h后于次日早晨8∶00時(shí)空腹用溫開(kāi)水200 mL單劑量吞服非洛地平片10 mg，并于服藥后4 h統(tǒng)一進(jìn)餐。于服藥前0 h及服藥后0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、6、8、10、12、24、48 h時(shí)各抽取靜脈血5 mL，分離血漿，于－20℃冰箱保存，供血藥濃度測(cè)定用。

2.6.3 數(shù)據(jù)處理：用DAS2.0藥動(dòng)學(xué)模塊程序處理藥-時(shí)數(shù)據(jù)。

2.7 藥效學(xué)研究

2.7.1 藥效指標(biāo)的選擇：選擇收縮壓（SBP）、舒張壓（DBP）、HR和平均動(dòng)脈壓（MAP）作為藥效測(cè)定的指標(biāo)。

2.7.2 藥效測(cè)定：藥效數(shù)據(jù)分別于服藥前0 h及服藥后0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0、6.0、8.0、10、12、24、48 h時(shí)測(cè)定，即每次采血的同時(shí)測(cè)定受試者臥位SBP、DBP、HR和MAP，取其平均值作為藥效結(jié)果。

3 結(jié)果

3.1 藥動(dòng)學(xué)結(jié)果

10名健康受試者單劑量口服非洛地平片10 mg后，平均血藥濃度測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。用DAS2.0藥動(dòng)學(xué)模塊程序處理藥-時(shí)數(shù)據(jù)，顯示其符合二室模型，平均藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見(jiàn)表2。

表1 非洛地平不同時(shí)間點(diǎn)的平均血藥濃度測(cè)定結(jié)果（n＝10，±s）Tab 1 Mean plasma concentrations of filodipine in 10 healthy volunteers at different time point（sn＝10，±s ）

表1 非洛地平不同時(shí)間點(diǎn)的平均血藥濃度測(cè)定結(jié)果（n＝10，±s）Tab 1 Mean plasma concentrations of filodipine in 10 healthy volunteers at different time point（sn＝10，±s ）

C/μg?L-1 00.69±0.241.46±0.731.86±0.802.66±0.684.14±1.555.06±1.525.84±1.234.07±0.872.64±0.781.87±0.791.36±0.730.84±0.470.26±0.07時(shí)間/h 00.511.522.5346810122448

3.2 藥效學(xué)結(jié)果

10名健康受試者單劑量口服非洛地平片10 mg前、后的平均藥效學(xué)結(jié)果見(jiàn)表3。

3.3 血藥濃度與藥效相關(guān)性

以不同時(shí)間血藥濃度平均值（Y），分別對(duì)ΔSBP（X1）、ΔDBP（X2）、ΔHR（X3）、ΔMAP（X4）的平均值進(jìn)行回歸分析，得回歸方程分別為：Y＝－3.284+0.7007X1（r1＝0.614，P＜0.01）；Y＝－4.354+1.368X2（r2＝0.9856，P＜0.01）；Y＝9.305+1.3252X3（r3＝0.9077，P＜0.01）；Y＝0.9336+0.4044X4（r4＝0.5686，P＜0.01）。其中ΔSBP＝SBPt－SBP0，即服藥后不同時(shí)間測(cè)得的SBP平均值減去服藥前測(cè)得的SBP平均值的絕對(duì)值。其它藥效指標(biāo)類推。

表2 10名健康受試者口服非洛地平片10 mg后的平均藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（n＝10，±s）Tab 2 Mean pharmacokinetic parameters of filodipine in 10 healthy volunteers after oral administration of 10 mg filodipine table（tn＝10，±s ）

表2 10名健康受試者口服非洛地平片10 mg后的平均藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（n＝10，±s）Tab 2 Mean pharmacokinetic parameters of filodipine in 10 healthy volunteers after oral administration of 10 mg filodipine table（tn＝10，±s ）

±s 3.88±0.355.94±1.4561.73±15.5467.62±16.090.73±0.3315.43±4.15參數(shù)tmax/h Cmax/μg·L－1 AUC0～48/μg·h·L－1 AUC0～∞/μg·h·L－1 Ka/h－1 t1/2/h x

表3 10名健康受試者口服非洛地平片10 mg前、后的平均藥效學(xué)結(jié)果（n＝10，±s）Tab 3 Mean pharmacodynamic indexes in 10 healthy volunteers after oral administration of 10 mg filodipine table（tn＝10，±s ）

表3 10名健康受試者口服非洛地平片10 mg前、后的平均藥效學(xué)結(jié)果（n＝10，±s）Tab 3 Mean pharmacodynamic indexes in 10 healthy volunteers after oral administration of 10 mg filodipine table（tn＝10，±s ）

時(shí)間/h 00.511.522.5藥效346810122448 SBP/mmHg 109±6110±11109±10108±8112±6112±7113±9108±9106±8107±11114±7111±11114±7113±8 DBP/mmHg 81±786±1376±777±1176±774±776±872±1067±1372±974±1278±981±1181±10 HR/次·min-1 80±1274±880±1379±1182±1375±672±774±976±975±577±675±971±874±5 MAP/mmHg 90±494±587±1287±888±687±486±487±880±684±1387±1089±692±892±10

服藥后的藥效指標(biāo)與未服藥時(shí)的相應(yīng)指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)用藥2、2.5、3、4、8 h的DBP均有明顯下降（0.01＜P＜0.05），用藥6 h的DBP有顯著下降（P＜0.01）。

4 討論

本文以獲得的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行藥效學(xué)/藥動(dòng)學(xué)關(guān)聯(lián)模型研究[4，5]，研究中發(fā)現(xiàn)非洛地平的藥動(dòng)學(xué)符合二室模型；藥效學(xué)不符合典型的S形Emax模型[6]，藥動(dòng)學(xué)和藥效學(xué)不符合直接連接和間接連接的藥效學(xué)/藥動(dòng)學(xué)關(guān)聯(lián)模型[7]，說(shuō)明模型機(jī)制不適于非洛地平藥物的血藥濃度與效應(yīng)研究。

本文對(duì)非洛地平在不同時(shí)間的血藥濃度與SBP、DBP、HR、MAP進(jìn)行相關(guān)回歸分析，相關(guān)系數(shù)分別為0.6146、0.9856、0.9077、0.5686，因而藥效與血藥濃度的相關(guān)性依次為DBP＞HR＞SBP＞MAP，提示臨床醫(yī)師應(yīng)用非洛地平時(shí)是否得到滿意療效，應(yīng)首先分析DBP的變化情況，并考察HR的變化。

本研究發(fā)現(xiàn)服用非洛地平2～8 h時(shí)間范圍內(nèi)，DBP下降明顯（P＜0.05或P＜0.01），從而可以初步確定非洛地平的有效血藥濃度約為2.64～5.84 μg?L－1。本研究結(jié)果可指導(dǎo)臨床應(yīng)用非洛地平的血藥濃度監(jiān)測(cè)和療效觀察分析。

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