郭志強(qiáng)，賈正平，馬 駿，王 榮，李文斌，吳蘭蘭

（蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院藥材科，蘭州市 730050）

細(xì)胞色素P450（Cytochrome P450，CYP450）同工酶代謝40%～50%的藥物，是主要的藥物代謝酶，具有基因多態(tài)性（Genetic polymorphisms）。盡管已知大約有30多種CYP450同工酶參與藥物代謝，但占主導(dǎo)地位的酶類主要有4種：CYP2D6、CYP3A4、CYP1A2和CYP2C9/19[1～3]。

Wrighton從人肝臟中分離得到S-美芬妥英4′-羥化酶（S-MP），并將其命名為CYP2C19[4]。CYP2C19具有多態(tài)性，代謝表現(xiàn)為強(qiáng)代謝型和弱代謝型，強(qiáng)代謝型能迅速進(jìn)行S-MP的4′-羥化代謝，弱代謝型則出現(xiàn)羥化代謝障礙。

CYP2C19 cDNA全長(zhǎng)1940 bp，其中編碼區(qū)為1473 bp，以ATG開始，以TGA終止[5]。本文研究的是第482 bp～第642 bp及第643 bp～第819 bp的編碼區(qū)。

CYP2C19主要參與代謝的藥物譜較為廣泛，包括質(zhì)子泵抑制劑、三環(huán)類抗抑郁藥、抗癲癇藥、抗精神病藥、降糖藥、抗凝藥、抗瘧疾藥以及抗癌藥等[6]。因此，研究CYP2C19基因多態(tài)性對(duì)CYP2C19參與代謝的藥物具有重要的基礎(chǔ)研究和臨床指導(dǎo)意義。

由于我國(guó)各地區(qū)環(huán)境、氣候及與其他民族交融情況不同，各地人口在遺傳背景大致相似的基礎(chǔ)上又各有特點(diǎn)，尤其是地處西北的甘肅，環(huán)境和生活條件與其他地區(qū)差異較大。因此，有必要研究不同地區(qū)CYP2C19基因的多態(tài)性。本文研究甘肅地區(qū)健康漢族人群CYP2C19的基因型和等位基因分布情況，并考察性別對(duì)CYP2C19基因多態(tài)性的影響。

1 材料

1.1 研究對(duì)象

由于CYP2C19的表型呈常染色體隱性遺傳，有血緣關(guān)系的人群其基因型和等位基因分布受遺傳影響而不能全面代表所考察人群的分布特征，所以選擇無(wú)血緣關(guān)系的受試者。通過(guò)詢問(wèn)、記錄受試者的家族史來(lái)評(píng)判其有無(wú)血緣關(guān)系。選擇甘肅地區(qū)104例無(wú)血緣關(guān)系的漢族健康志愿者，其中男性51例，女性53例，年齡18～43歲，平均（29.0±4.2）歲。所有受試者無(wú)嚴(yán)重疾病史，經(jīng)體格檢查及常規(guī)檢查均未見異常。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 試劑：Taq DNA聚合酶、10×PCR buffer、25 mmol·L－1MgCl2均為美國(guó)MBI公司產(chǎn)品；基因組DNA提取試劑盒、10 mmol·L－1dNTPs、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)物DNAMarkerⅠ為天根生化科技（北京）有限公司產(chǎn)品；BamHⅠ、SmaⅠ限制性內(nèi)切酶及其緩沖液購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2.2 儀器：PTC2150型PCR儀（美國(guó)MJ Research公司）；DYY-8C型電泳儀（北京六一儀器廠）。

2 方法

2.1 引物設(shè)計(jì)及合成

根據(jù)CYP2C19等位基因外顯子5和內(nèi)含子6以及外顯子4和內(nèi)含子5堿基序列（序列見NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)GeneBank NC_000010 REGION：96522463..96612671）用Primer Premier 5.0軟件分別設(shè)計(jì)外顯子5和外顯子4的特異性引物，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

外顯子 5（*2）的引物為：上游 5′-AAT TAC AAC CAG AGC TTG GC-3′；下游 5′-TAT CAC TTT CCA TAA AAG CAAG-3′。

外顯子4（*3）的引物為：上游5′-TAT TAT TAT CTG TTA ACT AAT ATG A-3′；下游 5′-ACT TCA GGG CTT GGT CAA TA-3′。

2.2 基因組DNA提取

取志愿者外周靜脈血3 mL，采用DNA提取試劑盒進(jìn)行DNA抽提，所得DNA于－20℃貯存，備用。

2.3 多聚酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（PCR-RFLP）分析

2.3.1 PCR擴(kuò)增：以前述提取所得基因組DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增。

2.3.2 CYP2C19*2位點(diǎn)擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)，最后72℃再延伸10 min。

2.3.3 CYP2C19*3位點(diǎn)擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性1 min，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)，最后72℃再延伸10 min。

2.3.4 PCR-RFLP分析：CYP2C19*2的等位基因擴(kuò)增得到284 bp的片段，用SmaⅠ進(jìn)行消化；CYP2C19*3的等位基因擴(kuò)增得到375 bp的片段，用Bam HⅠ進(jìn)行消化。酶切產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳后，紫外線燈下觀察帶型。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，基因型頻率和等位基因頻率采用基因計(jì)數(shù)法計(jì)算，性別間的頻率比較采用χ2檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05。

3 結(jié)果

3.1 PCR-RFLP分析結(jié)果

外顯子5擴(kuò)增產(chǎn)物為284 bp，突變發(fā)生在SmaⅠ的酶切位點(diǎn)，經(jīng)SmaⅠ消化后，顯示3種帶型：野生型有171 bp、113 bp 2個(gè)片段，雜合子型有284 bp、151 bp、113 bp3個(gè)片段，突變型純合子不能被切開而呈現(xiàn)284 bp的單一條帶。CYP2C19m1的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物SmaⅠ酶切后電泳結(jié)果見圖1。

圖1 CYP2C19m1的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物SmaⅠ酶切后電泳結(jié)果1.wt/wt野生型純合子；2.m1/m1突變型純合子；3.wt/m1突變型雜合子；4.DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量Fig 1 Electrophoresis of PCR products of CYP2C19m1 gene after digested by SmaⅠ1.wild-type homozygous（wt/wt）；2.homozygous for CYP2C19m1（m1/m1）；3.heterozygous for CYP2C19m1（wt/m1）；4.DNAmarker

外顯子4擴(kuò)增產(chǎn)物為375 bp，突變發(fā)生在BamHⅠ的酶切位點(diǎn)，經(jīng)BamHⅠ消化后，野生型可被切成224 bp、151 bp 2個(gè)片段，雜合子顯示375 bp、224 bp、151 bp 3個(gè)片段，突變型純合子不能被切開而呈現(xiàn)375 bp的單一條帶。CYP2C19m2的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物BamHⅠ酶切后電泳結(jié)果見圖2。

圖2 CYP2C19m2的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物BamHⅠ酶切后電泳結(jié)果1.DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量；2.m2/m2突變型純合子；3.wt/m2突變型雜合子；4.wt/wt野生型純合子Fig 2 Electrophoresis of PCR products of CYP2C19m2 gene after digested by BamHⅠ1.DNA marker；2.homozygous for CYP2C19m2（m2/m2）；3.heterozygous for CYP2C19m2（wt/m2）；4.wild-type homozygous（wt/wt）

3.2 性別對(duì)甘肅漢族人CYP2C19基因型和等位基因頻率的影響

本研究考察的CYP2C19基因型和等位基因頻率未受到性別的顯著影響，其基因型頻率比較的χ2＝0.354，P＞0.05。漢族不同性別CYP2C19基因型和等位基因頻數(shù)頻率分布見表1。

3.3 甘肅漢族人CYP2C19代謝表型分布

基因型為*1/*1者其代謝表型屬?gòu)?qiáng)代謝型純合子（EMhomo）；基因型為*1/*2、*1/*3者其代謝表型屬?gòu)?qiáng)代謝型雜合子（EMhete）；基因型為*2/*2、*2/*3、*3/*3者其代謝表型屬弱代謝型（PM）[4]。漢族不同性別CYP2C19代謝表型分布見表2，χ2＝0.141，P＞0.05，可見性別對(duì)其無(wú)顯著影響。

表1 漢族不同性別CYP2C19基因型和等位基因頻數(shù)頻率分布（n，%）Tab 1 The genotype and allele distribution of CYP2C19 in Han population with different gender（n，%）

表2 漢族不同性別CYP2C19代謝表型分布（n，%）Tab 2 The phenotype distribution of CYP2C19 in Han population with different gender（n，%）

3.4 不同地區(qū)間比較

本研究結(jié)果表明，甘肅漢族人群CYP2C19基因型與代謝表型存在多態(tài)性，而性別對(duì)此多態(tài)性無(wú)顯著性影響。甘肅漢族人群CYP2C19基因型及等位基因頻率與北京地區(qū)漢族人群[7]略有差異但基本一致（詳見表3），χ2＝1.738，P＞0.05，表明兩地區(qū)間差異并不顯著。

表3 不同地區(qū)漢族CYP2C19基因型和等位基因頻數(shù)頻率分布（n，%）Tab 3 The genotype and allele distribution of CYP2C19 in Han population from different areas（n，%）

4 討論

本研究考察甘肅漢族健康人群CYP2C19基因多態(tài)性和性別對(duì)其的影響，充實(shí)了我國(guó)人口和該基因的生物多樣性數(shù)據(jù)。隨著藥物基因組學(xué)在個(gè)體化藥物治療研究中的飛速進(jìn)展，這必將為更好地選擇藥物配伍、調(diào)整藥物劑量、預(yù)測(cè)藥物不良反應(yīng)提供理論和技術(shù)支持，進(jìn)而縮小相應(yīng)藥物療效的個(gè)體間差異，提高藥物使用效率，減少藥害事件的發(fā)生，最終提高個(gè)體化藥物治療水平。本研究考察樣本量尚顯不足，檢出突變型純合子較少，可繼續(xù)積累樣本并對(duì)其表型作進(jìn)一步研究。

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