郭抗抗，張彥明，張 紅，劉華科，寧蓬勃，王晶鈺

(西北農林科技大學 動物醫(yī)學院，陜西 楊凌 712100)

豬圓環(huán)病毒(Porcine circovirus，PCV)是圓環(huán)病毒科(Circoviridae)、圓環(huán)病毒屬(Circovirus)成員，為環(huán)狀、無囊膜、單鏈DNA病毒[1]。按致病性可將PCV分為2個型，即無致病性的PCV1和致病性的 PCV2[2]。PCV2是豬圓環(huán)病毒相關疾病(Porcine circovirus associated disease，PCVAD)的病原，可以引起以斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(Postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS)為代表的多種疾病，對養(yǎng)豬業(yè)的危害嚴重[3]。研究表明，根據基因組序列的差異將PCV2分為2個主要的型(群)，即PCV2A和PCV2B[4-5]。PCV2A基因組全長為1768 bp，PCV2B為1767 bp，兩者主要的差異位于ORF2區(qū)域，是由1040位(存在于ORF2)核苷酸的缺失或插入造成的。PCV2B在ORF2中有一段序列1486-TCA/AAC/CCC/CG，而PCV2A中序列則為ACC/AAC/AAA/AT，這是2個基因型的最大差異區(qū)域。有研究表明PCV2A和PCV2B致病性不同，PCV2B是造成近年來豬圓環(huán)病毒病在全球許多國家，特別是在北美地區(qū)暴發(fā)流行的主要原因，Carman[6]、Gagnon[5]和 Cheung[7]等都先后在研究中發(fā)現(xiàn)了PCV2B分離株大量增加的現(xiàn)象。

我國也是受PCV2危害嚴重的國家之一，國內有學者對PCV2分離株的基因型進行了檢測分類，認為目前國內豬群中也是以PCV2B型感染為主[8]，但在PCV2基因型的變化和當前主要流行基因型的分析方面可參考的資料有限。本研究對1999年～2009年GenBank登錄的PCV2分離株的基因型變化進行了分析。同時，建立了PCV2A和PCV2B PCR檢測方法，并對陜西省楊凌地區(qū)收集的部分病料的PCV2進行了檢測和基因型分析。

1 材料和方法

1.1 病毒株與病料 PCV2A和PCV2B的PK-15細胞培養(yǎng)物，由西北農林科技大學動物醫(yī)學院重大動物疾病防治與畜產品安全實驗室保存；病豬組織病料(腎臟、脾臟、肺和淋巴結)采自陜西省楊凌地區(qū)3個豬場的17頭患病仔豬和肥育豬；血液樣品采自楊凌某屠宰場生豬，分離血清，共53份。病料均在-40℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑和酶 AxyPrep基因組DNA小量試劑盒購自愛思進生物技術有限公司；PCR試劑購自Fermentas公司；小量凝膠回收試劑盒購自北京百泰克公司；限制性內切酶XbaⅠ購自寶生物工程(大連)有限公司；100 bp DNA Marker和DL2000 DNA Marker均購自北京索萊寶科技有限公司。

1.3 引物設計 對比NCBI登錄的PCV2A(36個分離株全序列)和PCV2B(75個分離株全序列)基因組的差異，篩選差異顯著區(qū)段分別設計可特異性擴增PCV2A和PCV2B的引物。引物序列如下：F-PCV2A：5'-C CAGTTCGTCACCCTTTCC-3'，R-PCV2A：5'-GGGG GACCAACAAAATCTC-3'，預期擴增產物長度為548 bp；F-PCV2B：5'-GTGGTCTACATTTCCAGCAG TT-3'，R-PCV2B：5'-GCTCAAACCCCCGCTC-3'，預期擴增片段大小為332 bp。引物由北京六合華大基因科技有限公司合成，使用濃度為10 μmol/L。

1.4 PCV2分離株全基因序列的獲得 在NCBI中檢索1999年～2009年PCV2分離株全基因序列，分析不同分離期間內PCV2基因型的變化；同時，對國內2003年～2009年PCV2分離株的基因型變化進行分析。

1.5 PCR檢測方法的建立 分別提取PCV2A和PCV2B感染的PK-15細胞培養(yǎng)物的總DNA(按試劑盒說明書進行)，以設計的特異性引物建立PCV2A和PCV2B的PCR檢測方法。對引物、dNTPs、DNA聚合酶的最佳濃度，PCR反應程序及方法的重復性進行優(yōu)化，并對PCR產物進行序列分析，以建立PCV2A和PCV2B的PCR檢測方法。測序由北京六合華大基因科技有限公司完成。

1.6 病料樣品檢測 分別提取病料樣品的總DNA(病料組織 15 mg/管～20 mg/管，血清 100 μL/管)，100 μL TE緩沖液溶解樣品DNA；用建立的PCR方法對病料中的PCV2A和PCV2B進行檢測，20 μL PCR體系中模板用量為1 μL。

2 結果與討論

2.1 PCV2分離株基因型的變化分析

2.1.1 PCV2分離株的基因型分析 共檢索到1999年～2009年PCV2分離株全序列556個?；蛐头治霰砻?，1999年～2000年的PCV2分離株均為PCV2A，2001年～2002年也以PCV2A為主，但已經有PCV2B毒株的出現(xiàn)；從2003年開始發(fā)現(xiàn)的PCV2B毒株比例超過PCV2A，并呈不斷升高的趨勢，其中2004年65個PCV2分離株中PCV2B為62個，占95.4%，在2007年～2009年均超過76%(表1)。雖然PCV2分離株優(yōu)勢基因型在不同的國家和地區(qū)存在差異，但可以確定PCV2B依然是目前PCV2的優(yōu)勢流行毒株，提示在疫苗開發(fā)和病毒致病性研究方面應考慮到不同國家主要流行毒株基因型的差異，使研究更有針對性。

Cheung等對2005年美國3個州(Iowa、Kansas、North Carolina)分離的24個PCV2分離株進行序列分析發(fā)現(xiàn)[7]，其中21個分離株為PCV2B。PCV2基因型的這種變化，可能是由于PCV2A/B之間的毒力存在差異，PCV2B的毒力要強于PCV2A，雖然近年來引發(fā)美國等一些國家的豬場出現(xiàn)PCV2疫情暴發(fā)，但目前還沒有十分確切的證據加以證明。也有研究表明，兩者在毒力或致病性上無明顯差異，但同一基因型內的不同分離株之間在毒力或致病性卻有明顯的差異[9]。

表1 1999年～2009年PCV2分離株基因型的變化Table 1 Genetic types variation of PCV2 isolates all over the world in 1999-2009

2.1.2 PCV2中國分離株基因型分析 郎洪武等的調查表明，國內豬群中存在PCV2的感染[10]。隨后各地進行的大量檢測工作發(fā)現(xiàn)，國內各類豬群中PCV2的感染可能比較普遍[11-15]。從2003年開始國內陸續(xù)有PCV2分離株的基因全序列報道，通過對國內2003年～2009年提交的PCV2分離株的序列分析表明，在統(tǒng)計年限內PCV2B均為主要流行毒株，特別是2007年～2009年分離株中PCV2B均占95%以上(表2)。在287個PCV2分離株中，PCV2B占250個，表明PCV2B是國內豬群中主要流行毒株；另外37個PCV2A分離株主要來自臺灣、山東、甘肅等地，提示PCV2的基因型也存在地區(qū)差異。

表2 2003年～2009年PCV2中國分離株基因型的變化Table 2 Genetic types variation of PCV2 isolates in China in 2003-2009

2.1.3 國外PCV2分離株基因型分析 據文獻報道1999年～2009年國外的PCV2分離株共269個，基因型分析表明，PCV2A在1999年～2003年、2005年和2009年均為優(yōu)勢毒株基因型，PCV2B在2004年、2006年～2008年為優(yōu)勢毒株基因型，這一結果與PCV2國內分離株的基因型變化存在差異(表3)。對分離株來源分析表明，PCV2基因型在不同國家情況也不同，如2005年后PCV2B在北美地區(qū)的檢出率大大增加，這可能與此時豬群中PCV2疾病的暴發(fā)有一定的關聯(lián)。

表3 1999年～2009年國外PCV2分離株基因型的變化Table 3 Genetic types variation of PCV2 isolates excluding China in 1999-2009

2.2 臨床樣品的檢測

2.2.1 PCV2A和PCV2B PCR檢測方法的建立 通過反應組份優(yōu)化確定PCR最佳體系為20 μL：含(NH4)2SO4的 10×PCR 緩沖液 2.0 μL，MgCl2(25 mmol/mL)1.8 μL，dNTPs(10 mmol/mL)0.4 μL，TaqDNA 聚合酶(5 u/μL)0.3 μL，上下游引物各1.0 μL，DNA 模板 1.0 μL，滅菌超純水補至 20 μL。PCR擴增條件為：95℃ 5 min；94℃ 30 s、56℃30 s、72℃40 s，40個循環(huán)；72℃10 min。

對PCV2A和PCV2B參考毒株的檢測表明，設計的引物具有較高的特異性，PCV2A引物只能從PCV2A DNA模板中擴增得到一條約550 bp的片段，PCV2B引物只能從PCV2B DNA模板中擴增得到一條約330 bp的片段，同時用2對引物可從PCV2A和PCV2B混合DNA模板中得到各自特異性產物，無交叉擴增現(xiàn)象發(fā)生(圖1)。重復性試驗表明，建立方法重復性較好。PCR產物測序表明，產物的基因序列與模板DNA 100%相符(測序結果略)。

2.2.2 臨床樣品檢測 用建立的PCR方法對70份臨床樣品進行檢測，共檢出PCV2陽性樣品24份，占34.29%(24/70)。基因型分析表明，分離株均為PCV2B(24/24)，這一結果與國內的PCV2分離株基因型分析一致，提示在PCV2的流行規(guī)律、遺傳變異以及致病性的研究方面，要結合病毒基因型分析，對不同基因型在PCV2相關疾病流行規(guī)律做進一步深入研究。

本研究對1999年～2009年PCV2分離株的基因型分析表明，PCV2B為當前的優(yōu)勢流行毒株，這種現(xiàn)象在國內尤為明顯；國外PCV2的優(yōu)勢基因型存在地區(qū)差異，但PCV2B在引起PCV相關疾病中作用明顯增強。以建立的PCV2A和PCV2B PCR方法對陜西楊凌地區(qū)采集的病料檢測也表明，PCV2B為當?shù)刎i群中的優(yōu)勢毒株。本研究結果為PCV2相關疾病的防控提供參考依據。

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