柴欣樓 王 偉 王綠婭 張永生

(1北京中醫(yī)藥大學，北京市朝陽區(qū)北三環(huán)東路 11號，100029;2北京市安貞醫(yī)院)

冠脈形成術造成了血管內皮細胞損傷，加速了血栓的形成。附壁血栓的形成，不僅造成血管的急性閉塞，而且為平滑肌細胞 (vessel smooth musle cell，VSMC)的內遷提供了框架，增殖的 VSMC由血管中層向內膜的遷移是內膜增厚的一個重要機制。在此過程中，細胞邊緣存在大量基質金屬蛋白酶(maxtrix metalloproteinases，MMPs)和纖維蛋白溶解酶，這 2種物質可降解細胞外基質，加速 VSMC的遷移[1]。VSMC遷移的結果可導致內膜中 VSMC的大量積聚和結締組織的形成，進而促進新生內膜形成。

葛根素(Pur)為異黃酮類化合物，屬于植物雌激素?，F(xiàn)代藥理研究證明 Pur在心血管中具有多種功能，可擴張心、腦血管，降低血黏度，抑制血小板活性，降低血小板黏附率;可對抗 H2O2引起的無血清培養(yǎng)的 VSMC凋亡及壞死[2]。

本研究以葛根素為研究對象，構建 VSMC遷移模型，Boyden小室法檢測 VSMC的遷移，ELISA法檢測MMP-2、MMP-9的含量，在此基礎上采用明膠—聚丙烯酰胺電泳酶譜分析 VSMC分泌 MMP-2的活性。

1 材料與方法

1.1 材料與分組 1)主要試劑:DMEM培養(yǎng)液(美國GIBCO公司產品)，胎牛血清 (FBS，Hyclone公司產品)，凝血酶(凍干粉，美國 Sigma公司產品)，葛根素原粉(純度 99.7%，由衛(wèi)生部藥品生物制品鑒定所提供)，MTT、二甲基亞砜(DMSO)、胰蛋白酶和 EDTA、SP免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒(北京中杉生物制品有限公司)，BCA蛋白定量試劑盒(美國 Bio-Rad公司)，MMP-2、MMP-9 ELISA試劑盒(鼎國試劑公司)。2)VSMC體外培養(yǎng)及鑒定:常規(guī)組織貼塊法培養(yǎng)VSMC。實驗用 4～8代細胞。用光鏡和免疫組化方法進行鑒定。3)藥物配制及梯度稀釋。4)葛根素原粉，選擇二甲基亞砜為溶劑，配制濃度分別為 10mM和1mM。將 1mM藥物溶液用溶劑以 1:10的比例進行梯度稀釋，使最終藥物濃度從 1mM變化到 1nM。5)分組。正常對照組:用含 1%小牛血清 DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞。模型組:加終濃度為 5u/L凝血酶的 1%小牛血清 DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞。葛根素組:加終濃度為5u/L凝血酶和濃度為 10-2mol?L-1的葛根素溶液的1%小牛血清 DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞。雷帕霉素組:加終濃度為 5u/L凝血酶和濃度為 10-4mol?L-1的雷帕霉素溶液的 1%小牛血清 DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞。

1.2 實驗方法 血管平滑肌細胞培養(yǎng):1)空氣栓塞法處死新西蘭大耳白兔，無菌條件下分離全段胸主動脈，立即置于含青霉素 100u/mL，鏈霉素 100mg/mL的無菌生理鹽水中。2)超凈工作臺上，用含青霉素、鏈霉素的生理鹽水反復沖洗，去除脂滴、血凝塊等雜質及可能殘留的內皮細胞和外膜成纖維細胞，然后將一次取材的 2～3條血管中膜組織混合在一起，置于無菌培養(yǎng)皿中。3)滴加少許培養(yǎng)液使組織保持濕潤，用眼科彎剪反復剪切成 1mm×1mm大小的組織塊。剪切好的組織小塊均勻置于瓶底，組織塊間距 0.5cm。蓋好瓶蓋，輕輕翻轉培養(yǎng)瓶，讓瓶底朝上并向瓶內注入含20%胎牛血清的 DMEM培養(yǎng)液，于 37℃孵箱內放置。4)經(jīng) 2～4h孵育后，將培養(yǎng)瓶慢慢翻轉平放，使組織塊完全浸入培養(yǎng)液中，繼續(xù)靜置培養(yǎng) 3～5d。待有細胞從組織塊周圍游出后換液。5)當細胞長成“峰”“谷”交錯的致密細胞層，即可進行傳代。

1.3 Boyden小室法檢測 VSMC的遷移

1.3.1 VSMC細胞，0.125%胰酶消化后離心 1000r/min×5min，PBS液洗滌 2次，離心，棄上清。

1.3.2 用含 10%CFBS的 DMEM培養(yǎng)液配成細胞密度 1×106個/L左右細胞懸液，使細胞在培養(yǎng)液中懸浮 1h恢復形態(tài)?；靹蚣毎麘乙?，吸取 0.35mL加入Boyden小室的上室內。

1.3.3 下室加入 2%CFBS的 DMEM培養(yǎng)液作為正常對照組，其余加入待測藥品等，封閉下室小孔，置37℃，5%CO2孵箱內培養(yǎng) 6h。

1.3.4 取出 Boyden小室內的微孔濾膜，PBS洗 2次，冷丙酮固定 10s，PBS洗 2次。

1.3.5 以蘇木素染色 5min，蒸餾水沖洗，1%鹽酸乙醇脫色 3min，流水沖洗，1%NaHCO3顯藍染色 3min。

1.3.6 水洗后，37℃過夜，系列梯度乙醇脫水:70%-75%-80%-90%-100%各 0.5min。

1.3.7 二甲苯透明。

1.3.8 以中性樹膠封片。設 5個重復孔。

1.3.9 在顯微鏡下，隨機計數(shù) 10高倍視野下移出濾膜的 VSMC數(shù)，每張膜觀察 2遍，計算其平均數(shù)。5份濾膜內的移動細胞平均數(shù)表示 VSMC的遷移數(shù)量。

1.4 ELISA法檢測 MMP-2、MMP-9的含量

1.4.1 VSMC細胞，0.125%胰酶消化后離心 1000r/min×5min，PBS液洗滌 2次，離心，棄上清。

1.4.2 用含 10%CFBS的 DMEM培養(yǎng)液配成細胞密度 1×106個/L左右細胞懸液，6孔培養(yǎng)板，加入細胞懸液 1000μL繼續(xù)培養(yǎng) 48h后，去培養(yǎng)液。

1.4.3 加入無血清培養(yǎng)基培養(yǎng) 24h后，棄上清。加入待測藥品等，繼續(xù)培養(yǎng) 24h。

1.4.4 將上述細胞收集，低速離心，保留上清。加入96孔培養(yǎng)板，100μL/孔，設 5個重復孔。

1.4.5 建立標準曲線。酶標儀檢測吸光度值(490nm)。

1.5 明膠—聚丙烯酰胺電泳酶譜分析 VSMC分泌MMP-2的活性

VSMC細胞，0.125%胰酶消化后離心 1000r/min×5min，PBS液洗滌 2次，離心，棄上清。

1.5.1 用含 10%CFBS的 DMEM培養(yǎng)液配成細胞密度 1×106個/L左右細胞懸液，6孔培養(yǎng)板，加入細胞懸液 1000μL繼續(xù)培養(yǎng) 48h后，去培養(yǎng)液。

1.5.2 加入無血清培養(yǎng)基培養(yǎng) 24h后，棄上清。加入待測藥品等，繼續(xù)培養(yǎng) 24h。

1.5.3 將上述細胞收集，低速離心，保留上清。

1.5.4 Bradford法測培養(yǎng)液蛋白濃度，牛血清白蛋白作標準。

1.5.5 按常規(guī)方法灌制 10%分離膠和 5%濃縮膠，但分離膠中含 0.1%明膠作為底物。取 10μL上清液樣本與等體積的上樣緩沖液混合，室溫放置 30min，上樣，電流 15mA電泳約 90min，溴酚藍到達兩層膠的分界處，將電流調至 20A，電泳 90min后溴酚藍到達底線，停止電泳。

1.5.6 小心將膠剝離，經(jīng) 2.5%TritonX-100漂洗1h，加入反應緩沖液(50mmol/L Tris-HCL，10mmol/L CaCl2，20mmol/LNaCl)37℃過夜。

1.5.7 次日，0.5%考馬斯亮蘭染色 4h，脫色至藍色背景下白色條帶清晰可見。將凝膠掃描成像。

實驗重復 3次，以空白對照的條帶的灰度值為 1，實驗數(shù)據(jù)與空白對照相比取值。

1.6 統(tǒng)計學方法 所有數(shù)據(jù)由 SPSS統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析，以 ˉx±s表示，P＜0.05認為有統(tǒng)計意義。

2 實驗結果

2.1 VSMC細胞的鑒定結果 倒置相差顯微鏡觀察細胞生長形態(tài)及生長規(guī)律。VSMC呈長梭形、三角形或星形等。細胞突起較長，相互接觸，對數(shù)生長期細胞呈典型“峰與谷”樣生長。核較大，原形或卵原形，胞漿豐富。密度大時可重疊生長。

2.2 葛根素對 VSMC的遷移的影響(ˉx±s，n=6)葛根素組與模型組相比，P＜0.01。

2.3 葛根素對 VSMC分泌的 MMP-2、MMP-9含量的影響 (ˉx±s，n=6) VSMC分泌的 MMP-2、MMP-9含量。葛根素高濃度組與模型組相比，P＜0.01;葛根素低濃度組與模型組相比，P＜0.05。

2.4 葛根素對 VSMC分泌的 MMP-2活性的影響實驗原理:實驗以明膠為底物，明膠被考馬斯亮藍染為藍色背景，若樣本中含有可以分解明膠的 MMP-2則在相應分子量處可出現(xiàn)底物被水解的透明條帶，且根據(jù)條帶的灰度值可以反映酶活性的大小。若以不同的膠原或酪蛋白為底物，可以測出不同種類 MMPs的活性。

表1 VSMC分泌的 MMP-2灰度值

3 討論

早期血管彈性回縮，晚期血管重塑和新內膜增生是直接導致 PTCA術后再狹窄的三個主要原因[3]。植入支架雖可擴大管徑，防止彈性回縮發(fā)生，但支架本身對新生內膜的形成無任何抑制作用，而且它作為異物停留在體內可能導致血栓形成并刺激 VSMC增生和新生內膜肥厚，最終導致支架內再狹窄的發(fā)生[4]。

VSMC是血管壁的主要細胞成分之一，是決定血管順應性和血管重構的重要因素，血管壁增厚和順應性下降主要源于 VSMC的肥大、增生，產生和分泌細胞外基質增加等[5]。內膜損傷后內皮細胞釋放的血管活性物質和生長因子與 VSMC膜受體結合后使癌基因激活、轉錄、表達異常，VSMC由收縮表型轉化為合成表型，從細胞周期 G0期脫逸出并進入細胞增殖周期，發(fā)生分裂增殖并分泌大量的細胞外基質[6]。因此，在新生內膜形成過程中，VSMC移行、增殖和分泌是血管內膜增生的三個重要步驟[7]。

細胞外基質(extracellular matrix，ECM)主要包括膠原、糖蛋白、葡萄糖氨基糖苷和蛋白聚糖四類。在正常組織，這些大分子存在于內膜、中膜、外膜，起保持血管彈性和完整性的作用。研究表明成熟的 VSMC沒有遷移的特性，而且當其處于 S或 G2/M期時不能遷移，而只有在 G1向 G1/S轉化過程中才可能遷移[8-9]。中膜 VSMC的遷移除與細胞本身有關外，還須突破細胞周圍的遷移屏障即成分復雜的 ECM，因此在損傷早期 ECM降解，對促進 VSMC遷移有重要作用，晚期ECM沉積對血管重塑起重要作用。MMPs主要降解ECM[10]，在正常的血管中內皮細胞和 VSMC經(jīng)常產生MMP-2，TIMP-1和 TIMP-2，成為血管組織細胞更新必不可少的條件。根據(jù)降解的對象不同，將 MMPs分為 4類:MMP-1(膠原酶)、MMP-2(明膠酶 A)、MMP-3(基質裂解素 1)、MMP-9(明膠酶 B)、MMP-12(金屬蛋白彈性酶)，膜型金屬蛋白酶。當白介素1、腫瘤壞死因子、γ干擾素、巨噬細胞集落刺激因子、巨噬細胞化學趨化蛋白Ⅰ等炎癥細胞因子濃度升高時，促進 VSMC、內皮細胞和泡沫細胞表達 MMPs。這可降解 ECM，促進淋巴細胞和巨噬細胞遷移到內皮下;促進 VSMC由中膜遷移到內膜。故研究細胞外基質的降解，對于 VSMC的遷移有重要意義[11]。本實驗建立了細胞遷移模型，并在此基礎上觀察了 MMP-2和 MMP-9，結果發(fā)現(xiàn)葛根素可抑制 VSMC的遷移，同時，抑制 MMP-2、MMP-9，在此基礎上繼續(xù)觀察了葛根素對 VSMC分泌的 MMP-2活性的影響，發(fā)現(xiàn)葛根素組與模型組相比可顯著抑制 MMP-2的表達(P＜0.05)。關于葛根素抑制 VSMC遷移，通過本實驗的研究可以發(fā)現(xiàn)，葛根素抑制了 VSMC的增殖，使處于G1期的細胞較多，增加了其遷移到內膜下組織的機會，因而抑制其遷移過程變得尤為重要。但細胞遷移受多種因素影響，不僅僅與 MMP-2、MMP-9有關。這也成為今后研究關注的焦點問題。

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