陳吳健，吳 蓉，林曉佳

（浙江出入境檢驗(yàn)檢疫局，浙江 杭州 310012）

毛刺屬線蟲傳毒種及其研究進(jìn)展

陳吳健，吳 蓉，林曉佳

（浙江出入境檢驗(yàn)檢疫局，浙江 杭州 310012）

摘要：介紹了毛刺屬線蟲的圓桶毛刺線蟲（Trichodorus cylindricus）、原始毛刺線蟲（T. primitivus）、具毒毛刺線蟲（T. viruliferus）、相似毛刺線蟲（T. similis）4種傳毒線蟲種類，綜述了這4種傳毒種毛刺屬線蟲傳毒的?；?、形態(tài)學(xué)鑒定、分子生物學(xué)鑒定的研究進(jìn)展，并提出了檢疫部門今后的研究重點(diǎn)是為一線人員提供快速、精確、靈敏的檢疫方法。

關(guān)鍵詞：毛刺線蟲；傳毒種；?；裕昏b定技術(shù)

毛刺線蟲在世界大部分地區(qū)都有報(bào)道發(fā)生，并廣泛分布于歐洲、南、北美洲，通過直接取食或傳播植物病毒，嚴(yán)重危害多種栽培作物和野生植物[1]（見表1），其中傳播病毒造成損失遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于線蟲本身取食造成危害，因此其作為傳毒線蟲引起了各國的重點(diǎn)關(guān)注。我國于2007年5月正式對外公布的進(jìn)境植物檢疫性有害生物名單中，包含了所有的傳毒線蟲種類，其中就包括毛刺屬線蟲傳毒種。

1 毛刺屬線蟲傳毒種及其所傳病毒

Trudgill[2]提出了長針科線蟲作為病毒介體必須符合一系列標(biāo)準(zhǔn)：①病毒和線蟲的特征必須能夠準(zhǔn)確的鑒定；②試驗(yàn)表明誘餌植物組織為病毒侵染；③試驗(yàn)中介體線蟲的種是唯一可能的介體。Brown等[3]根據(jù)Trudgill對已報(bào)道的毛刺線蟲或擬毛刺線蟲傳毒文獻(xiàn)進(jìn)行的評價(jià)，發(fā)現(xiàn)40篇中，只有12篇完全符合標(biāo)準(zhǔn)，隨后提出用單個(gè)毛刺線蟲測定其傳毒的新方法，給評價(jià)毛刺線蟲傳毒提供了可行的方法，該方法完全符合Trudgill提出的標(biāo)準(zhǔn)。經(jīng)過研究，Brown等[4]提出毛刺屬只有4種線蟲能夠傳毒，分別為：圓桶毛刺線蟲（Trichodorus cylindricus）、原始毛刺線蟲（T. primitivus）、具毒毛刺線蟲（T. viruliferus）、相似毛刺線蟲（T. similis）。

毛刺科線蟲傳播的病毒為煙草脆裂病毒屬（Tobravirus）病毒。煙草脆裂病毒屬病毒為桿狀粒體，共有3個(gè)確定種，其中草脆裂病毒（Tobacco rattle virus，TRV）、豇豆早褐病毒（Pea early-browning virus，PEBV）兩種由毛刺屬線蟲傳播，辣椒環(huán)斑病毒（Pepper ringspot virus，PRV）由擬毛刺屬線蟲傳播[5～7]。

表1 毛刺屬線蟲傳毒種的地理分布和寄主范圍[10]Table 1 Geological distribution and host range of virus-vector ofTrichodorusnematodes

2 毛刺屬線蟲傳毒?；?/h2>

2.1 毛刺屬線蟲與所傳病毒的?；越M合

毛刺線蟲種與傳播的病毒種或株系之間具有高度的?；运?，可達(dá)到介體種的不同種群或微小差異的病毒血清型株系上的?；猿潭萚5,8～9]（見表2）。

表2 毛刺屬線蟲種與植物病毒間?；越M合[5]Table 2 Specificity ofTrichodorusspecies with plant viruses

2.2 毛刺屬線蟲的傳毒機(jī)理

毛刺線蟲所傳帶病毒被吸附在整個(gè)食道壁及食道和腸連接的瓣門上，但是在毛刺上沒有病毒粒體[10]。線蟲對病毒粒體的保留和釋放，有兩種假說：

電荷假說：線蟲的病毒保留位點(diǎn)和病毒粒體各帶有不同電荷，通過正負(fù)電荷吸引而使粒體保留在有效位點(diǎn)，一種病毒的不同株系可能表面帶有的電荷密度不同，就需要不同介體線蟲種來傳播；而不同病毒種如能由同一介體線蟲種傳播，則可能是因?yàn)椴《揪哂邢嗨频碾姾擅芏取?jù)推測，病毒粒體的釋放可能是在線蟲取食時(shí)食道腔內(nèi)的pH值發(fā)生變化，從而改變粒體表面電荷、釋放粒體[5～6]。

分子識別假說：毛刺線蟲食道內(nèi)壁層上具有碳水化合物粘層，而病毒外殼蛋白(CP)可能具有類似凝集素的特性，二者之間存在分子識別關(guān)系而進(jìn)行結(jié)合，病毒粒體的傳播可能依賴于病毒蛋白外殼的特性[5～6]。

2.3 毛刺屬線蟲傳毒?；缘姆肿訖C(jī)制

試驗(yàn)表明，病毒基因組RNA-2片斷在線蟲傳播中起了重要作用[7]。RNA-2片斷編碼病毒外殼蛋白和1～3種非結(jié)構(gòu)蛋白[11～12]。核磁共振研究表明，煙草脆裂病毒屬病毒外殼蛋白C一末端具有一突出粒體表面的片斷，可能與病毒粒體在介體內(nèi)的保留位點(diǎn)起作用[5,13～14]。

原始毛刺線蟲可傳播PEBV-TpA56，但不能傳播PEBV-SP5株系。分析2個(gè)株系RNA-2編碼的3種分子量分別為9、29.6、23 ku的非結(jié)構(gòu)蛋白發(fā)現(xiàn)，編碼29.6 ku蛋白的基因與線蟲傳播有關(guān)[15]。Macfarlane等[16]通過誘變試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，PEBV-TpA56所有非結(jié)構(gòu)基因可能都與線蟲介體傳播有關(guān)，Schmitt等[17]在隨后的誘變試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，23 ku基因不是線蟲傳播的必要條件，但影響線蟲傳播頻率。Macfarlane[13]的研究表明非結(jié)構(gòu)蛋白基因還和線蟲傳播的專化性有關(guān)。

3 毛刺屬線蟲傳毒種鑒定的研究進(jìn)展

3.1 形態(tài)學(xué)研究

3.1.1 毛刺屬的研究[10]由于毛刺科線蟲的雌雄蟲都具有豐富的形態(tài)分類特征，所以雌雄蟲的形態(tài)特征都被用于種屬的鑒定。毛刺屬雌蟲以生殖腺的單雙、受精囊的有無、陰道長度、陰道骨化結(jié)構(gòu)的大小、陰道收縮肌的發(fā)達(dá)程度、陰門形態(tài)、陰門區(qū)側(cè)體孔的有無等分類特征，區(qū)分于毛刺科其他各屬。毛刺屬雄蟲的鑒定則主要根據(jù)交合傘的有無、蟲體后部的彎直、交合刺懸肌囊的發(fā)達(dá)程度、交配乳突數(shù)、交合刺形態(tài)及飾紋附屬物、縮回交合刺區(qū)內(nèi)交配乳突數(shù)、頸乳突數(shù)、側(cè)頸孔數(shù)等特征。

3.1.2 毛刺屬4個(gè)傳毒種的形態(tài)學(xué)研究 Decraemer[10]對毛刺屬的種的鑒定特征進(jìn)行了詳細(xì)描述，對4種傳毒毛

刺線蟲的雌雄蟲特征描述如下：

3.1.2.1 雌蟲特征

原始毛刺線蟲：陰道骨化結(jié)構(gòu)桿狀，間距寬，平行于陰道腔；瘤針長28～57μm。

具毒毛刺線蟲：陰道骨化結(jié)構(gòu)桿狀，但較短、近卵形，間距寬，平行于陰道腔；陰道長菱形；瘤針長28～57 μm。

相似毛刺線蟲：陰門橫裂；陰道長菱形；陰道骨化結(jié)構(gòu)略小，不平行于體縱軸線，圓三角形，相距近；一個(gè)陰門后側(cè)體孔；瘤針長36～52μm。

圓筒毛刺線蟲：陰道桶形；陰道骨化結(jié)構(gòu)中等大小，不平行于體縱軸線，三角形，其頂端指向陰門、傾斜；瘤針長35～52μm。

3.1.2.2 雄蟲特征

原始毛刺線蟲：有3個(gè)腹中頸乳突，瘤針區(qū)內(nèi)有2個(gè)，第二個(gè)正好位于瘤針基部后；縮回交合刺區(qū)有1個(gè)腹中交配乳突；交合刺桿部的后半部非常細(xì)，交合刺中部的縊縮有時(shí)不清楚，剛毛有時(shí)不清楚，交合刺長32～54μm。

圖1 4種傳毒毛刺屬線蟲的雄蟲交合刺形態(tài)Figure 1 Spicule morphology of 4 maleTrichodorusnematodes

圖2 4種傳毒毛刺屬線蟲的雌蟲陰門及陰道骨化結(jié)構(gòu)形態(tài)Figure 2 Vulva and vaginal sclerotization of 4 femaleTrichodorusnematodes

具毒毛刺線蟲：有3個(gè)腹中頸乳突，位于瘤針區(qū)內(nèi)有2個(gè)，第二個(gè)正好位于瘤針基部后；縮回交合刺區(qū)無腹中交配乳突；交合刺較細(xì)，中間較短的有缺刻區(qū)，剛毛不明顯，交合刺長22～37μm；瘤針長32～53μm。

相似毛刺線蟲：有3個(gè)腹中頸乳突，位于瘤針區(qū)內(nèi)有1個(gè)；交合刺有球形柄，粗，長30～44μm；瘤針長35～50μm。

圓筒毛刺線蟲：有3個(gè)腹中頸乳突，位于瘤針區(qū)內(nèi)有1個(gè)；蟲體后部直，有交合傘；交合刺桿的后部膨大，交合刺無球形柄，長28～49μm。

3.2 毛刺屬線蟲傳毒種的分子鑒定

毛刺線蟲種的形態(tài)學(xué)鑒定，要求鑒定人員具有良好的分類學(xué)基礎(chǔ)。分子生物學(xué)在其它線蟲的鑒定中已得到廣泛應(yīng)用[19～21]，但是在毛刺屬線蟲的鑒定中應(yīng)用很少。Boutsika等[22]對來自兩個(gè)毛刺屬和擬毛刺屬的四個(gè)種（Paratrichodorus macrostylus, P. pachydermus, T. primitivus和T. similis）的rDNA序列特征進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)其18S和5.8S基因高度保守，相反的，ITS序列的變異度比較大。T. primitivus和T. similis的ITS序列長度分別為1537 bp和1 303 bp，是線蟲門中已報(bào)道最長的ITS序列，是擬毛刺屬兩個(gè)種的2～3倍，但是GC含量沒有顯著性差異。

在之后的研究中，Boutsika等[23]設(shè)計(jì)了針對P. macrostylus、P. pachydermus、T. primitivus和T. similes4個(gè)種的特異性引物，并成功運(yùn)用單條成蟲的DNA完成了PCR擴(kuò)增，獲得的PCR產(chǎn)物大小依次為：497、329、256、452 bp。傳毒線蟲種的特異性引物，結(jié)合該線蟲所傳播的TRV病毒株的特異性引物一并擴(kuò)增，被用來檢測地塊傳播TRV病毒的可能性。

Holeva[24]設(shè)計(jì)了一套基于實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)的檢測傳毒毛刺線蟲與其所傳病毒的方法。針對P. macrostylus、T. similis的18S基因分別設(shè)計(jì)了特異性引物和探針，同時(shí)分別針對TRV的RNA1、TRV-Ppk20和TRV-Tpo120毒株的RNA2設(shè)計(jì)了3對引物和探針，并成功完成了單一樣品的試驗(yàn)；希望運(yùn)用該方法通過對地塊土樣的檢測，快速、靈敏、準(zhǔn)確獲得該地塊內(nèi)線蟲病毒的種類、數(shù)量等分子信息，為該地塊的風(fēng)險(xiǎn)評估提供可靠的依據(jù)。

4 問題和展望

針對四種傳毒毛刺屬線蟲，無論是傳毒的分子機(jī)理，還是分子生物學(xué)鑒定，主要是由Brown等專家研究，但近幾年未有新的報(bào)道；其次關(guān)于T. primitivus和T. similis研究的相對較多，但對圓桶毛刺線蟲、具毒毛刺線蟲的研究幾乎為空白。針對T. primitivus和T. similis的特異性引物已有報(bào)道，但是同時(shí)檢測多種線蟲的PCR方法有待開發(fā)。Boutsika等[23]報(bào)道其設(shè)計(jì)的T. similis引物的PCR結(jié)果不穩(wěn)定，并懷疑所用的DNA提取方法不適用于T. similis，其提取方法有待改良。T. cylindricus、T. viruliferus的傳毒機(jī)理、傳毒?；缘姆肿訖C(jī)理等是否與T. primitivus、T. similis類似，有待進(jìn)一步研究。作為檢疫部門，探索T. cylindricus、T. viruliferus是否也存在與T. primitivus、T. similis一樣變異度較大的ITS區(qū)，設(shè)計(jì)鑒定種的特異性引物，為一線人員提供快速、精確、靈敏的檢疫鑒定方法，是今后研究工作的重點(diǎn)。

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中圖分類號：S154.38＋6

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1001-3776（2010）04-0094-05

收稿日期：2010-03-10；修回日期：2010-05-05

基金項(xiàng)目：國家“十一五”重大科技支撐計(jì)劃“農(nóng)林重大生物災(zāi)害防控技術(shù)研究”項(xiàng)目“潛在入侵物種口岸偵測技術(shù)”（2006BAD08A13）

作者簡介：陳吳?。?983－），男，浙江仙居人，碩士，從事植物檢疫研究。

Research Advances on Virus-vector of Trichodorus Nematodes

CHEN Wu-jian，WU Rong，LIN Xiao-jia
（Zhejiang Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau, Hangzhou 310012, China）

Abstract:Presentation was made on virus-vector types of four species ofTrichodorus, likeT. cylindricus,T. primitivus,T. viruliferusandT. similis. The research advances were summarized on virus-vector specificity of transmission, morphological and molecular identification for vector Trichodorus species. The future research will be focused at quick, precise and sensitive method for quanrantine.

Key words:Trichodorusnematodes; virus-vector; specificity; identification