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        脂多糖對不同發(fā)育期小鼠肝臟β-防御素3表達的影響*

        2010-05-07 02:27:10羅詠梅鄭筠
        四川生理科學雜志 2010年4期
        關鍵詞:孵育試劑盒染色

        羅詠梅 鄭筠

        (1.四川省建筑醫(yī)院藥劑科,四川 成都 610041;2.中國醫(yī)藥集團總公司四川抗生素研究所,四川 成都 610041)

        當機體受到外界病原微生物、炎癥因子以及細胞因子刺激時,會激活天然免疫系統(tǒng)產生內源性抗生素肽(Endogenous antibiotic peptide),簡稱抗菌肽。而作為抗菌肽家族成員之一的防御素,是一類小分子陽離子多肽,分子量在3000-4500 Da之間。根據(jù)其分子結構主要分為三類:α-,β-,θ-防御素。它們具有廣譜的抗微生物作用,對大多數(shù)的革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、真菌、流感病毒以及 HIV等等,均有明顯的殺傷或抑制作用[1-3]。小鼠防御素,包括隱凹素(α-防御素)(Cryptdin)以及β-防御素,目前發(fā)現(xiàn)并已經成功克隆的小鼠β-防御素主要包括mBD-1、-2、-3、-4、-5、-6、-7、-8、-9、-11、-12、-13、-14以及-35[4-7]。mBD-1是一種廣泛存在于不同上皮的抗菌肽,在腎中的表達量最高,LPS不能誘導其表達,其與人β-防御素1同源性最高[4];mBD-3在食管、氣管以及舌中具有固有表達,經LPS或是革蘭氏陰性菌感染可在肝、胃腸道以及肺中誘導表達,其與人β-防御素2在結構,功能上相似性最高[5];mBD-4在舌、食管以及氣管的上皮中固有表達量最高,氣管給予銅綠假單胞菌PAO1注射后,未發(fā)現(xiàn)其在肺內表達量有明顯改變,但是并不代表其它的刺激物無法引起本身的誘導表達,其與人β-防御素2在蛋白序列及功能上也具有較高的相似性[6]。

        由于小鼠防御素與人防御素之間存在很多的共通之處,所以小鼠防御素成為了研究防御素功能以及作用機制的主要對象。對于人防御素在發(fā)育過程中起到的關鍵作用,以往的文獻中提到β-防御素以及抗菌肽其他家族成員LL-37在肺部的發(fā)育過程中起到的重要保護作用[7],以及在新生兒肺部感染中防御素起到的重要的防御作用[8],但是迄今為止,鮮有文獻報道防御素在其他重要器官發(fā)育過程中的關鍵作用。通過本文的研究,了解小鼠防御素mBD-3在正常以及受到LPS感染的不同發(fā)育時期小鼠肝臟的表達情況,為進一步研究防御素在胎兒及新生兒感染方面提供依據(jù),也為進一步探索防御素在天然免疫中的作用奠定基礎。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        健康5周齡ICR小鼠,購自簡陽達碩動物中心。T rizol試劑(Invitrogen,USA),其余試劑均來購自成都寶信生物技術公司。二步法 RT-PCR試劑盒(Tiangen,Japan)。RT-PCR試劑盒,PCR mix試劑購自北京天根公司。一抗:anti-mBD-3(Santa Cruz,USA);anti-β-actin(Santa Cruz,USA)。BCA 蛋白試劑盒(pierce,USA);ECL發(fā)光試劑盒購自北京奧科生物技術有限公司。顯影液,定影液以及膠片購自柯達公司。牛血清白蛋白(BSA)(Sigma,Japan);Tween-20、2-巰基乙醇(Sigma,USA),其余用品均為國產分析純;小鼠SP檢測試劑盒購自成都寶信生物技術公司。

        1.2 方法

        1.2.1 實驗動物的準備

        健康ICR小鼠,5~6周齡,飼養(yǎng)于定溫空調房內,早晨定時給水及飼料。使用注射器腹腔注射雌鼠PMSG 5 U?只-1,再42-48 h后注射 HCG 10 U?只-1。雌鼠:雄鼠按 2∶1的比例合籠。定時熄燈,于晚上12時觀察交配情況。翌日,檢查雌鼠陰道是否有白色陰栓出現(xiàn),見陰栓的雌鼠單獨飼養(yǎng),此時為0.5 d。妊娠雌鼠隨機分組,每組50只,按日待用。

        1.2.2 LPS注射建立小鼠模型

        LPS感染組(n=50)孕鼠(E13.5、E16.5)經腹腔注射550μg?kg-1LPS,24 h 后,取母鼠、胎鼠(E14.5、E17.5)的肝臟備用,在孕期17.5 d的孕鼠注射550μg?kg-1LPS,取新生鼠(P0、P4)的肝臟備用,新生鼠成年后(三周齡)取肝臟備用;正常對照組(n=50)同時間注射同量的生理鹽水,同時間取小鼠肝臟備用。

        1.2.3 RT-PCR檢測不同發(fā)育期小鼠肝臟mBD-3 mRNA表達

        按Trizol法提取肝臟總RNA。按照北京天根公司試劑盒說明書,將 RNA反轉錄為 cDNA,以β-actin作為內對照。反應體系中加入 25 μ l 2 ×mRNA selective PCR buffer I,1 μ l Rnase inhibitor,10 μ l M gCl2,5 μ l dNTP,1 μ l AMV taq,補齊體 積為50 μ l。程序如下:42℃,40min;94℃預變性 2min;94℃變性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸45 s,30個循環(huán);最后72℃延伸7min。反應結束后取5 μ l PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳觀察。引物序列如下:

        基因 上游引物 下游引物 片段長度(bp)mBD-3 5'-CTCTTTGCATTTTCC TGGTG-3'5'-GGGAGCACTGTTTGC ATTT-3' 235 β-actin 5'-AACCCTAAGGCCAAC CGTG-3'5'-CAGGATTCCATACCC AAGAAGG-3' 650

        1.2.4 Western-blotting檢測不同發(fā)育期小鼠肝臟mBD-3蛋白表達

        不同發(fā)育時期的肝臟蛋白提取步驟按南京凱基公司蛋白提取試劑盒說明書進行,簡要程序如下:按組織凈重∶裂解液=1∶10的比例,制備組織勻漿液。室溫靜置 10min,離心10,000 rpm×10min,棄上清,室溫10min空氣干燥沉淀。所得蛋白,按BCA蛋白濃度測定試劑盒(Pierce)說明書方法測定蛋白濃度。T ricine-SDS-PAGE電泳分離不同的蛋白條帶,12 V 4℃冰箱濕轉過夜。取出PVDF膜,一抗孵育:將對應抗體按1(200用一抗稀釋液稀釋后(總體積為 5ml),加入雜交袋中,4℃雜交袋內孵育過夜。移去一抗孵育液,用足量TBST洗液振蕩洗滌3×10min。二抗孵育:將HRP標記的二抗(羊抗兔IgG)按1∶5000用封閉液稀釋(總體積為5ml),加入雜交盒內,室溫振蕩孵育1 h。移去二抗孵育液,用足量 TBST洗液振蕩洗滌3×10min。PVDF膜浸到ECL化學熒光試劑中顯色,然后定影,顯影。

        1.2.5 免疫組化

        不同發(fā)育時期的左半葉肝臟取出后,用0.1 mol?L-1磷酸鹽緩沖液(PBS)洗凈血跡,置于0.1%DEPC的4%多聚甲醛溶液中固定,30%乙醇 15min,50%乙醇 15min,75%乙醇15min,85%乙醇15min,95%乙醇10min(2次),100%乙醇10min(2次)梯度脫水,乙醇二甲苯(1∶1)15min,二甲苯5-10min,二甲苯石蠟(1∶1)15min,浸蠟1 h(3次),石蠟包埋。載玻片用APES防脫片劑處理,撈片后置烤箱58~60℃孵育30~60min;切片梯度無水乙醇以及二甲苯常規(guī)脫蠟;30%H2O2滴在切片上,室溫5~10min滅活內源性酶,蒸餾水洗3次;熱修復抗原:將切片浸入0.01 M枸櫞酸鹽緩沖液(PH6.0),微波爐加熱間隔5~10min后,反復1~3次,冷卻后用磷酸緩沖液(PBS)(PH7.2~7.6)洗滌1~2次;滴加5%山羊血清封閉液,室溫孵育20min;滴加適當稀釋的相對應的一抗,放入濕盒中,4℃過夜,取出后PBS洗2min×3次。滴加生物素化二抗,20~37℃30min,PBS洗2min×3次;滴加新鮮配制的三抗,20~37℃20min,PBS洗5min×4次;滴加新鮮配制的DAB溶液顯色。蘇木素輕度復染30 s,梯度無水乙醇脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片。上述染色均設陽性對照片和陰性對照片,陽性對照片為已知切片,陰性對照片為PBS替代一抗,顯微鏡觀察,陽性結果為胞漿內出現(xiàn)棕黃色顆粒。

        1.2.6 免疫組化結果判定

        每張切片隨機選10個視野,高倍鏡下(×400)以細胞漿或膜出現(xiàn)定位清晰的淡黃色至棕褐色顆粒狀物質為陽性。根據(jù)陽性細胞膜或漿的染色程度及染色細胞百分率評分,行半定量分析:根據(jù)陽性細胞比例以及染色的細胞水平進行半定量分析。每個抗原的表達評分標準為:0分:無染色;1分:弱染色;2分:強染色占到25%或中度染色<80%;3分:強染色占到25%-50%或是中度染色>80%;4分:強染色>50%。每種情況,要計算10個最具有代表性的視野的比值。

        1.3 統(tǒng)計學處理

        2 結果

        2.1 mBD-3 mRNA在不同發(fā)育期小鼠肝臟表達

        RT-PCR結果顯示:正常對照組中,mBD-3 mRNA在肝臟中的表達量微弱至無法檢測到,僅在出生后第四天檢測到較弱的表達。而mBD-3在 LPS誘導后原未見基礎有表達的肝臟出現(xiàn)誘導表達,隨著發(fā)育天數(shù)的增加,胎鼠、新生鼠以及成年鼠的肝臟的誘導表達逐漸的增強,在成年后受感染,肝臟的mBD-3表達量達到最高。這說明在發(fā)育過程中,胎鼠受到感染后的防御能力在逐漸增強(圖1)。

        圖1 不同發(fā)育時期小鼠肝臟mBD-3 mRNA表達電泳圖

        2.2 mBD-3蛋白不同發(fā)育期小鼠肝臟表達以及在肝臟中的分布

        Western blotting結果顯示:mBD-3蛋白在肝臟中的表達趨勢與其RNA的表達趨勢基本一致。正常對照組同樣未檢測到mBD-3蛋白表達,而在LPS感染組,mBD-3出現(xiàn)了誘導表達,且隨著發(fā)育天數(shù)的增加,胎鼠、新生鼠以及成年鼠的肝臟中mBD-3誘導表達逐漸的增強,這種表達在小鼠成年后的肝臟中達到最高(圖2)。

        圖2 不同發(fā)育時期小鼠肝臟mBD-3蛋白表達電泳圖

        在小鼠肝臟發(fā)育過程中,正常對照組中,未發(fā)現(xiàn)明顯表達mBD3的陽性細胞,但是在肝細胞漿中有零星的陽性表達,且隨著發(fā)育時間的增加,這種零星表達分布逐漸增多(圖 3 A、C、E、G、I)。而在LPS感染組,在肝細胞索以及肝細胞內部及肝血竇中均發(fā)現(xiàn)大量的mBD3陽性表達細胞,尤其是在庫夫氏細胞胞漿內這種陽性表達尤其明顯,且隨著發(fā)育時間的增加,陽性細胞量逐漸的增多,分布也逐漸的變廣。胚胎發(fā)育中期14.5天,經過LPS誘導在肝臟組織中有較明顯的mBD-3表達(圖 3 B),到胚胎晚期,第 17.5天時,小鼠胚胎發(fā)育成熟,接近成鼠水平(圖3 D),在LPS感染組的表達最高(圖3 F、H、G)。LPS感染組的陽性表達明顯高于正常對照組(圖3),組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。

        3 討論

        母體感染LPS對母體本身危害極大,也是導致胎兒的宮內死亡,早產,宮內發(fā)育遲滯,早發(fā)性爆發(fā)性新生兒肺炎及死亡的重要原因之一。防御素則具有抵抗LPS感染的功能,同時鼠的β-防御素同人β-防御素有許多相似的地方,比如廣泛存在于多種器官組織上皮,有廣譜的抗微生物作用,也有固有表達和誘導表達兩種方式,同人防御素HBD-2一樣都位于小鼠第8號染色體上的特點?;谕葱?、上游調控元件、表達方式的共通性,所以本實驗選擇了mBD-3來觀察LPS刺激后不同發(fā)育時期小鼠肝臟β-防御素表達的差異。本實驗重點就在于研究LPS感染對胎鼠、新生鼠以及成年鼠產生防御性β-防御素的影響,從而對于人β-防御素對抗孕期LPS感染提供借鑒性的實驗依據(jù)。

        1999年,小鼠β-防御素 3(mBD-3)被成功克隆出來,其cDNA序列同HBD-2具有36.7%的同源性,同 HBD-1僅有25.3%的同源性。其氨基酸序列同HBD-2的相似序列達到了39.7%。mBD-3序列由兩個外顯子將1.7 kb長的內含子分開,在其5'端側翼鏈含有 TATA盒以及 NF-κ B的同源結合序列。通過原位雜交的方法檢測的結果發(fā)現(xiàn),骨骼肌未檢測到表達,在唾液腺、胰腺以及生殖道(睪丸)上皮發(fā)現(xiàn)mBD-3的高表達。在腦、肝、肺、卵巢均有表達,在胚胎發(fā)育 7天就有表達,在11天時達到最高,后在胚胎15天表達又有所下降。后經氣管注射綠膿桿菌PAO1,再使用RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)在肺、小腸以及肝中的表達量迅速增高。在肝臟的表達,在以后的研究中發(fā)現(xiàn)LPS感染可導致肝臟的急性相反應,產生大量的mBD-3。在2002年的研究中,結果顯示 mBD-3在舌、肺、心、肝、腎、脾以及陰莖、骨骼肌都沒有發(fā)現(xiàn)基礎表達。但是在使用革蘭氏陰性菌感染以后,發(fā)現(xiàn)其在舌、食管、肺、肝以及小腸的表達增加了[5]。后期研究發(fā)現(xiàn)mBD-3,mBD-4以及mBD-6在多種組織中均能檢測到,如食管、舌和氣管,附睪組織以及骨骼肌中均有發(fā)現(xiàn),而利用ICR小鼠,腹腔注射 LPS后,利用RT-PCR可檢測到肺內的 mBD-3以及 mBD-6表達增加[6]。

        而本實驗在前人研究的基礎上,進一步探討了mBD-3在小鼠不同發(fā)育時期肝臟的表達及LPS感染對其在肝臟發(fā)育期中表達的影響。肝臟發(fā)育的關鍵階段為第15-16天,此時基本形成成年肝臟,且共有四個肝葉,即是左、右、中和尾葉。在正常情況下,肝臟并未檢測到mBD-3的基礎表達,而在LPS刺激下,mBD-3展示了其誘導表達的特性。通過RT-PCR以及Western blotting檢測其在肝臟不同發(fā)育時期的基因及蛋白的表達變化,以及免疫組化檢測其分布。結果顯示在肝臟的各發(fā)育階段mBD-3誘導表達均約有60%以上的增加,而這種增加的趨勢,隨著小鼠的發(fā)育而不斷的增強。這種現(xiàn)象可能與鼠的β-防御素基因上游序列炎癥反應元件組成或類型有關。mBD-35'側翼端具有 NF-κ B以及 IL-6、AP-1反應元件,而這些元件正是人β-防御素發(fā)生誘導表達的關鍵轉錄元件,提示我們LPS很有可能通過這些反應元件來調控mBD-3誘導表達。而且隨著發(fā)育天數(shù)的增加,在受到外界刺激的時候,小鼠肝臟誘導防御素的能力逐漸增強,而且從免疫組化的結果看來陽性細胞分布的范圍也較廣,這說明在小鼠發(fā)育的過程中,肝臟在受到感染時,防御的能力隨著器官分化的逐步增加,而逐漸的增高,但在這其中各種反應元件如何發(fā)揮作用以及在其他組織的mBD-3的基礎表達及誘導表達的變化趨勢,將是我們進一步需要實驗研究的問題。

        4 結論

        本實驗結果表明不同發(fā)育時期小鼠的肝臟在正常情況下,均未見mBD-3的表達,但是在LPS感染情況下,小鼠肝臟大量表達mBD-3,且隨著小鼠發(fā)育的天數(shù)的增加,其誘導表達逐漸增加,提示該分子在肝臟組織發(fā)揮天然免疫防御作用中占據(jù)重要的地位。

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