張小芳 趙健雄

原花青素(procyanidins,Pc),是廣泛存在于水果、蔬菜、種籽、花朵和樹皮中的一類多酚化合物的總稱[1],其中葡萄籽原花青素提取物(grape seed procyanidin extract,GSPE)為最早提取成功的原花青素,對其研究也最為廣泛。由于 GSPE安全性(GSPE:口服急性毒性 LD50＞5 000mg/kg,急性皮膚毒性 2 000mg/kg)、高效和高生物利用率等,使原花青素在食品、醫(yī)藥、化妝品等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用[2]。尤其是近幾年原花青素抗腫瘤的作用越來越受到人們的關(guān)注,據(jù)報道原花青素對皮膚癌、口腔癌、乳腺癌、肝癌、肺癌、前列腺癌、胰腺癌、胃癌、結(jié)腸癌等都有一定的預(yù)防或治療作用,但單獨(dú)應(yīng)用療效并不理想。基于此我們研究 GSPE對于肺癌的放療增敏作用,為擴(kuò)大 GSPE的臨床應(yīng)用和肺癌的放射增敏治療提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料

GSPE:天津市尖峰天然產(chǎn)物研究開發(fā)有限公司;小牛血清:杭州四季青公司產(chǎn)品;RMPI-1640培養(yǎng)基干粉:GIBCO公司產(chǎn)品;噻唑藍(lán)(MTT)和碘化丙啶(PI):SIGMA公司產(chǎn)品。倒置相差顯微鏡:OLYMPUS IX70,OLYMPUS公司產(chǎn)品;BIO-RAD iMark自動酶標(biāo)儀,日本 BIO-RAD公司;流式細(xì)胞儀(FCM):EPICS XL,COULTER公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 MTT法檢測 GSPE對 X射線增敏作用 取對數(shù)生長期細(xì)胞,0.25%胰酶消化,吹打均勻,計(jì)數(shù),稀釋至 5×104個 /ml,細(xì)胞懸液以 90μl/孔接種至 96孔板,培養(yǎng)貼壁 24 h后加藥處理。實(shí)驗(yàn)設(shè)陰性對照組(細(xì)胞懸液 +PBS,用于計(jì)算抑制率)、空白對照組(無細(xì)胞的 DMEM完全培養(yǎng)液 +PBS,用于消除培養(yǎng)液顏色誤差)、原花青素各劑量組(細(xì)胞懸液 +不同濃度的原花青素),原花青素各劑量顏色對照組(無細(xì)胞的DMEM完全培養(yǎng)液 +不同濃度的原花青素,用于消除藥物的顏色誤差),10μl/孔加藥,每個濃度設(shè) 3復(fù)孔。陰性對照組和空白對照組加 pH 6.8的磷酸鹽緩沖液,置培養(yǎng)箱培養(yǎng) 24 h后進(jìn)行 X射線照射。照射參數(shù):6 MeV直線加速器下,在 2.5 Gy/min時以不同劑量照射,源皮距為 100 cm。照射結(jié)束后繼續(xù)培養(yǎng) 4天,取出每孔中加入 MTT 10μl(5mg/m l),再培養(yǎng) 4 h后,吸去培養(yǎng)液,加入二甲基亞砜(DMSO)150μl,震蕩10min,酶標(biāo)儀單波長 490 nm測定每孔吸光度值(OD)。按下列公式計(jì)算抑制率(IR)。

抑制率(IR,%)=[(陰性A均值 -空白A均值)-(實(shí)驗(yàn) A均值 -顏色 A均值)]/(陰性 A均值 -空白 A均值)×100%

1.2.2 集落形成法檢測 GSPE對 X射線照射后細(xì)胞增殖的抑制作用 對數(shù)生長期的各組細(xì)胞,0.25%胰酶消化制備細(xì)胞懸液。60 mm培養(yǎng)皿中分別按藥物劑量不同種入不同數(shù)量的細(xì)胞。細(xì)胞貼壁后,分別給予不同劑量藥物(0、25、100、200 μg/m l)作用 24 h,再給予 0、1、5、9 Gy劑量照射,每組 3個復(fù)孔。照射后置37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 8～10天。取出后倒去培養(yǎng)液,PBS漂洗 2次,用醋酸甲醇固定,姬姆薩染色 10min,在解剖鏡下計(jì)數(shù)直徑大于 50 m(或含 50個細(xì)胞以上)的細(xì)胞克隆。按以下公式計(jì)算存活分?jǐn)?shù)。

存活率 =某劑量的集落形成數(shù)/某劑量下種植的細(xì)胞數(shù) ×100%

1.2.3 流式細(xì)胞儀檢測腫瘤細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期分布 取對數(shù)生長期細(xì)胞,消化,計(jì)數(shù),調(diào)整細(xì)胞濃度至5×105/m L,貼壁 24 h后,對照組加 PBS液,實(shí)驗(yàn)組加入 GSPE,培養(yǎng) 48 h后,X射線照射,照射結(jié)束繼續(xù)培養(yǎng) 48 h后收集細(xì)胞。1 000 r/min離心 5 min,用冷的PBS洗 2次,棄上清,加入 300μg/mL PBS,制成細(xì)胞懸液。將0.7mL預(yù)冷的無水乙醇沿管壁分多次加入,4℃固定過夜。上機(jī)前用 PBS洗 2次,加入 100μg/m LRNA酶,37℃消化 30min,酶切 RNA;加 50μg/mL碘化丙啶(PI),4℃避光染色。用 200目細(xì)胞篩過濾后在流式細(xì)胞儀上檢測(激發(fā)波長 488 nm,吸收波長 600 nm)。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

MTT各組吸光度值值差異采用單因素方差分析,SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件。集落形成存活率分析采用單擊多靶模型曲線擬合,graphpad Prism 5.0軟件。用計(jì)算機(jī)自帶 Multicycle(Phoenix Flow System,San Diego,CA,USA)軟件分析,計(jì)算出細(xì)胞周期分布和凋亡情況。

2 結(jié)果

2.1 MTT檢測 GSPE增敏殺傷作用

檢測不同藥物濃度在不同劑量的 X射線照射下的增敏作用,抑制率結(jié)果見表 1。對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析,結(jié)果表明:X射線和 GSPE均可顯著影響腫瘤細(xì)胞的存活率,并且兩者之間存在協(xié)同關(guān)系,統(tǒng)計(jì)有顯著性差異(P＜0.01)。

但兩者對細(xì)胞殺傷的貢獻(xiàn)不同,為進(jìn)一步分析兩者之間的相關(guān)性,固定其中 1個因素水平即 X射線劑量,研究各濃度藥物的增敏作用。結(jié)果表明,在藥物濃度小于 25μg/mL時,藥物對腫瘤細(xì)胞沒有殺傷作用,也無增敏作用;藥物濃度 50μg/mL時,藥物對腫瘤細(xì)胞無殺傷作用,但有增敏作用;100μg/mL時,藥物對腫瘤細(xì)胞有殺傷作用,同時也有增敏作用;大于 200 μg/m L時,藥物對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用強(qiáng)于 X射線的殺傷,表現(xiàn)為協(xié)同作用。所以 50～100μg/mL可以認(rèn)為是 GSPE的有效增敏濃度。

表1 MTT檢測GSPE合用X射線對SPC-A-1細(xì)胞抑制率±s)

表1 MTT檢測GSPE合用X射線對SPC-A-1細(xì)胞抑制率±s)

藥物濃度(μg/m L)X射線劑量(Gy)0 1 3 5 7 9 12.5 0.00±0.35 0.00±2.46 0.00±2.07 0.00±3.44 4.50±6.22 17.36±0.26 25 4.51±0.05 3.32±4.69 2.29±3.80 5.46±1.09 11.36±0.79 25.06±0.05 50 7.57±1.22 14.10±1.26 10.66±2.32 13.76±9.98 21.82±11.30 41.38±1.05 100 24.31±7.53 37.37±2.71 40.48±2.35 35.35±6.02 45.09±3.91 56.55±2.20 200 44.58±2.27 44.68±1.61 53.46±1.73 58.04±1.25 77.47±0.14 75.50±0.31 400 51.57±0.51 54.75±1.77 67.50±1.33 68.41±1.31 86.29±2.73 83.01±0.16 800 55.18±1.24 57.93±2.33 68.42±0.18 71.25±0.03 87.90±1.07 83.05±0.63

2.2 集落形成法研究藥物和 X射線對肺癌細(xì)胞的增殖抑制作用結(jié)果

腫瘤細(xì)胞具有無限增殖的潛力,但以藥物干預(yù)或X射線照射后會使部分未立即死亡細(xì)胞在繼續(xù)分裂數(shù)代后停止增殖。所以集落形成法觀察細(xì)胞的增殖抑制作用,結(jié)果見表 2。以“多靶單擊模型”進(jìn)行曲線擬合,“多靶單擊模型”方程:SF=1-(1-e-D/D0)N,Dq=D0lnN,Dq=lnN/k,其中 SF為存活分?jǐn)?shù),D為放射劑量(Gy),D0代表平均致死量,Dq代表準(zhǔn)域劑量,N為外推數(shù),它是曲線指數(shù)區(qū)存活分?jǐn)?shù)下降 63%所需的照射劑量,反應(yīng)不同細(xì)胞對射線敏感性和同 1種細(xì)胞放射敏感性的變化;存活分?jǐn)?shù)(SF)的計(jì)算方法為:處理組集落形成率/對照組集落形成率。增敏比 SER=單純照射組的 D0/增敏照射組的 D0。通過一系列實(shí)際實(shí)驗(yàn)的D和得到的相應(yīng)的一系列 SF,通過曲線擬合出其中的K和 N這兩個參數(shù),所以 K和 N是通過曲線擬合計(jì)算出的數(shù)值,K沒有具體意義,其意義有 D0來表示。其他參數(shù)比如 D0,Dq等都可以根據(jù) K、N兩個參數(shù)求出。集落形成結(jié)果表明 GSPE為 100μg/m l對 X射線增敏作用明顯,藥物作用后 D0值降低,表明細(xì)胞對 X射線敏感性增加;Dq變小,說明細(xì)胞修復(fù)亞致死損傷的能力變?nèi)?N值減小則細(xì)胞在低劑量區(qū)時對亞致死損傷的耐受性降低,增敏比為 2.56,見表 3。

表2 集落形成法測定藥物和X射線對肺癌細(xì)胞的抑制率(%)

表3 100μg/mLGSPE劑量增敏曲線分析

2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡

分別比較空白對照組(0 Gy),單獨(dú) X射線照射組(1 Gy,5Gy)和藥物增敏 X射線組(100μg/m L原花青素 1 Gy,5 Gy)流式細(xì)胞術(shù) PI染色圖的差異。我們發(fā)現(xiàn)藥物增敏 X射線組細(xì)胞出現(xiàn)了明顯的凋亡峰,提示亞二倍體 DNA含量的細(xì)胞數(shù)量明顯增加,細(xì)胞凋亡率(28.2%)顯著高于單純照射組(14.9%)及空白對照組(5.3%),見圖 1。藥物增敏 X射線組與對照組及單獨(dú) X射線照射組比較,差異均有非常顯著性意義(P＜0.01)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明:原花青素可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,并將細(xì)胞阻滯于 G1期。

圖1 藥物增敏X射線組對細(xì)胞凋亡的影響

3 討論

惡性腫瘤是危害人類生命和健康的 1種嚴(yán)重疾病,其中肺癌是導(dǎo)致全球人群死亡數(shù)最多的惡性腫瘤,癌癥的放射治療越來越受到人們的重視。但由于腫瘤異質(zhì)性的存在,不可避免的存在放射抵抗,使腫瘤對放療的治療反應(yīng)不一,它是影響放療治療劑量的主要因素之一,也直接影響了腫瘤放療的效果。提高腫瘤的放療敏感性一直是醫(yī)學(xué)上的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。原花青素(PC)是由不同數(shù)量的兒茶素或表兒茶素縮合而成的一大類酚類化合物,廣泛分布于植物界,許多食品和飲料中都含有豐富的原花青素。近年來的研究顯示,具有極強(qiáng)的抗氧化活性,是 1種很好的氧游離基清除劑和脂質(zhì)過氧化抑制劑,它還有清除自由基、調(diào)節(jié)免疫抗彈性酶,抗誘變等多種藥理活性[3]。除此之外,它可抑制皮膚癌、口腔癌、乳腺癌、肝癌、肺癌、前列腺癌、胰腺癌、胃癌、結(jié)腸癌等多種腫瘤細(xì)胞的生長,誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡[4]。Huyny等[5]發(fā)現(xiàn),用 PC處理的人體乳腺癌細(xì)胞中測得的凋亡數(shù)比未處理的同種細(xì)胞高的多;而在正常人乳腺細(xì)胞樣品中,PC并不明顯改變凋亡的數(shù)量。Shih等[6]研究了原花青素不僅抑制胃腺癌細(xì)胞的增殖,而且可以誘導(dǎo)其凋亡。Bomser等[7]研究了抑制誘導(dǎo)的小鼠皮膚腫瘤發(fā)展的活性。有學(xué)者研究原花青素對肺癌的治療作用,對肺癌細(xì)胞和大鼠多臟器癌癥模型的肺癌均有較好的治療和預(yù)防作用,因此,本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)研究 GSPE的放療增敏作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明 GSPE對肺癌 SPC-A-1細(xì)胞有較好的放療增敏作用,增敏劑量在 50～100μg/mL之間,低于該劑量增敏效果不顯著。在增敏劑量下對單獨(dú) X射線照射和藥物作用后 X射線照射細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)進(jìn)行曲線擬合,分析結(jié)果表明,GSPE對 X射線有顯著的增敏作用,藥物作用后 D0值降低,表明細(xì)胞對 X射線敏感性增加;Dq代表準(zhǔn)域劑量,它反映肩區(qū)的大小,表明細(xì)胞亞致死損傷修復(fù)能力。藥物作用后,Dq變小,說明細(xì)胞修復(fù)亞致死損傷的能力變?nèi)?N值減小則細(xì)胞在低劑量區(qū)時對亞致死損傷的耐受性降低,增敏比為 2.56。既往研究認(rèn)為,細(xì)胞的放射敏感性與細(xì)胞凋亡水平有關(guān),細(xì)胞凋亡反應(yīng)越強(qiáng)放射敏感性越高,快速凋亡細(xì)胞的放射敏感性最強(qiáng)。流式細(xì)胞術(shù)(PI染色法)結(jié)果發(fā)現(xiàn)原花青素與放療聯(lián)合應(yīng)用凋亡率較對照組和單純放療組明顯增加,提示原花青素能增強(qiáng) SPC-A-1細(xì)胞對放療誘導(dǎo)凋亡的敏感性,推測這可能與原花青素改變細(xì)胞周期的分布有關(guān)。在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)它能使 G0/G1期細(xì)胞比例明顯增加,S期和 G2/M期減少,這樣便相應(yīng)抑制了腫瘤細(xì)胞進(jìn)入 DNA合成期和有絲分裂期,促進(jìn)了細(xì)胞的凋亡,增加了放療的敏感性。

[1] Bagchi D,Bagchi M,Stohs SJ,et al.Free radicals and grape seed proanthocyanidin extract:importance in human health and disease prevention〔J〕.Toxicology,2000,148:187.

[2] Ray S,Bagchi D,Lim P,et al.Acute and long-term safety evaluation of a novel IH 636 grape seed proanthocyanidin extract〔J〕.Res-Commun-Mol-Pathol-Pharmacol,2001,109(3～4):165.

[3] 鄭 敏,梅賢臣,鮑翠玉.大蒜多糖體外抗柯薩奇病毒B 3作用〔J〕.中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)雜志,2005,22(1):4.

[4] 李素梅,穆春蘭.原花青素的研究進(jìn)展〔J〕.黑龍江醫(yī)藥,2006,19(3):201.

[5] Huyny TH,Teel RW.Selective induction of apop tosis in human mammary cancer cells(MCF-7)by pycnogenol〔J〕.Anticancer Res,2000,20(4):2417.

[6] Shih PH,Yeh CT,Yen GC.Effects of anthocyanidin on the inhibition of proliferation and induction ofapoptosis in human gastric adenocarcinoma cells〔J〕.Food Chem Toxicol,2005,43(10):l557.

[7] Bomser J,Madhavi DL,Singletary K,et al.In vitro anticancer activity of fruit extracts from Vaccinium species〔J〕.Planta Med,1996,62(3):212.