史慧星,陳 云,游慶朋,楊 磊,袁 紅

宮頸癌是女性常見惡性腫瘤,宮頸癌的發(fā)生與發(fā)展是多因素多階段演變的結(jié)果,多種癌基因及抑癌基因參與了癌變過程。今后的目標(biāo)是在力爭早期診斷的同時(shí),在分子生物學(xué)基礎(chǔ)上確定宮頸癌發(fā)生及發(fā)展的始動(dòng)環(huán)節(jié),采用針對性的靶向治療。Wnt信號(hào)傳導(dǎo)通路是一種對控制胚胎發(fā)育有重要作用、進(jìn)化上保守的信號(hào)傳導(dǎo)通路,其決定細(xì)胞的分化和增生。研究表明 Wnt信號(hào)傳導(dǎo)通路不恰當(dāng)?shù)募せ顓⑴c了多種人類腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。Wnt通路致癌的關(guān)鍵是 β-連環(huán)蛋白 (β-catenin)降解障礙致使胞質(zhì)內(nèi)游離的 β-catenin聚集并與 Tcf/lef結(jié)合進(jìn)入細(xì)胞核,激活下游靶基因細(xì)胞周期蛋白 D1(cyclinD1)的轉(zhuǎn)錄,導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。Wnt信號(hào)通路途徑的改變在大腸癌發(fā)生中的作用已較明確,在其他惡性腫瘤中的改變也顯示出重要意義,深入了解該途徑的特點(diǎn)及其在宮頸癌中的變化對于宮頸癌的早期診斷、預(yù)后判斷及靶向治療研究具有重要的意義。本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測正常宮頸鱗狀上皮組織、宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變 (cervical intraepithelial neoplasia,CIN)、宮頸鱗癌組織中 β-catenin與 cyclinD1的表達(dá)情況,分析其表達(dá)率的變化,探討其在 Wnt信號(hào)通路中對宮頸鱗癌發(fā)生、發(fā)展的作用。

1 對象與方法

1.1 研究對象 標(biāo)本來源于 2007年 4月—2008年 12月河北省邢臺(tái)市人民醫(yī)院及邢臺(tái)礦業(yè)集團(tuán)總醫(yī)院病理科宮頸癌手術(shù)和活檢的存檔蠟塊?；颊咝g(shù)前均未行放療或化療。宮頸鱗狀細(xì)胞癌 42例 (宮頸癌組),按組織學(xué)分級:Ⅰ級 8例;Ⅱ級 22例;Ⅲ級 12例。其中有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者 10例,無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者 32例?；颊吣挲g 31～68歲,平均 48.9歲。CIN 20例 (CIN組,其中 CINⅡ級 9例,CINⅢ級 11例)。同時(shí)取正常宮頸組織 8例作為正常對照組。

1.2 試驗(yàn)材料 β-catenin鼠抗人單克隆抗體為 ZYMED公司產(chǎn)品。CyclinD1兔抗人多克隆抗體為 Labvision公司產(chǎn)品。羊抗鼠二步法通用型試劑盒。羊抗兔二步法通用型試劑盒。EDTA抗原修復(fù)液。封閉用正常山羊血清工作液。顯色底物:3,3-二氨基聯(lián)苯胺 (DAB)。以上試劑均購自北京中山生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法 (1)采用 β-catenin免疫組織化學(xué)染色:二甲苯脫蠟 10 min×2,梯度乙醇入水 (100%×1,90%×1,80%×1)各 10 min,PBS緩沖液 5 min×1,在 3%甲醇 -過氧化氫混合液室溫 15 min,滅活內(nèi)源性過氧化物酶,PBS緩沖液 5 min×3,EDTA抗原修復(fù)液,微波爐高火 2.5 min,解凍檔 10 min,室溫冷卻 30 min,PBS緩沖液 5 min×3,10%山羊血清封閉,濕盒內(nèi)室溫 30 min,β-cat鼠抗人單克隆抗體 (工作液 1:100),濕盒內(nèi) 4℃過夜,PBS緩沖液 5 min×3,羊抗鼠二步法工作液濕盒內(nèi)室溫 30 min,PBS緩沖液 5 min×3,DAB顯色液,組織顯色后用自來水中止反應(yīng),Mayer氏蘇木精染液20 s,自來水沖洗,乙醇脫水 (80%×1、90%×1、100%×1)各 10 min,二甲苯透明,中性樹脂封片。 (2)cyclinD1免疫組織化學(xué)染色。方法同上,以 cyclinD1兔抗人多克隆抗體和羊抗鼠二步法工作液代替 β-cat鼠抗人單克隆抗體和羊抗鼠二步法工作液。

1.4 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) β-catenin:正常表達(dá)定位于細(xì)胞膜,細(xì)胞膜上有均勻的棕黃色著色,而胞漿中無染色或僅有微弱著色。細(xì)胞膜染色明顯減弱或消失同時(shí)胞漿或細(xì)胞核著色則判定為異常表達(dá)。cyclinD1:CyclinD1染色后棕黃色顆粒位于細(xì)胞核為陽性,以陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)。染色細(xì)胞 ＜5%為陰性 (-),≥5%陽性細(xì)胞為陽性 (+)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用 SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用 χ2檢驗(yàn),四格表確切概率法和 Spearman相關(guān)分析,以 P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 β-catenin在正常宮頸鱗組織、CIN及宮頸癌中的表達(dá)β-catenin在 8例正常宮頸鱗狀上皮組織中均未見異位表達(dá)(見圖1),在 CIN、宮頸鱗癌組織中的異位陽性表達(dá)率比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (χ2=4.69,P＜0.05)。正常宮頸組織中 β-catenin主要在胞膜表達(dá),CIN和宮頸鱗癌中 β-catenin在胞膜表達(dá)明顯減弱或缺失,隨著病變的發(fā)展,β-catenin逐漸呈現(xiàn)在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)表達(dá),而宮頸鱗癌中胞質(zhì)的表達(dá)進(jìn)一步增強(qiáng),但本組未發(fā)現(xiàn)有明顯的細(xì)胞核內(nèi)表達(dá) (圖 2～3)。β-catenin在宮頸鱗癌不同組織分級中異位表達(dá)率間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=9.30,P＜0.01);CIN組因例數(shù)較少未再行不同分級間比較。宮頸鱗癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組 β-catenin異位陽性表達(dá)率與未轉(zhuǎn)移組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (χ2=0.00,P＞0.05,見表 1～2)。

2.2 cyclinD1在正常宮頸組織、CIN及宮頸鱗癌中的表達(dá)cyclinD1在正常宮頸上皮細(xì)胞中均未見陽性表達(dá),cyclinD1陽性表達(dá)定位于細(xì)胞核 (見圖 4～5)。cyclinD1在 CIN、宮頸鱗癌組陽性表達(dá)率間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (χ2=5.52,P＜0.05,見表 1)。在宮頸鱗癌各分級組織中 cyclinD1陽性表達(dá)率間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (χ2=5.52,P＜0.05);宮頸鱗癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組 cyclinD1的陽性表達(dá)率與未轉(zhuǎn)移組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.36,P＞0.05,表 1～2)。

表1 β-catenin、cyclinD1在正常對照組、CIN及宮頸鱗癌組織中的表達(dá)比較Table 1 The expression ofβ-catenin and cyclinD1 in squamous cervical carcinoma,cervical intraepithelial neoplasia

表2 β-catenin、cyclinD1在宮頸鱗癌中的表達(dá)與組織分級及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系Table 2 Correlation between the expression ofβ-catenin and cyclinD1 and tumor differentiation and lymph node involvement in squamous cervical carcinoma

圖1 β-catenin在正常組織中的表達(dá) (×400)Figur e 1 Membranous immunostaining ofβ-catenin in normal squamous cervical epithelium

圖2 β-catenin在 CIN組織中的表達(dá) (×400)Figure 2 Abnormal expression ofβ -catenin in CIN

圖3 β-catenin在宮頸鱗癌組織中的表達(dá) (×400)Figur e 3 Ectopic cytoplasmic accumulation ofβ -catenin in squamouscervical carcinoma

2.3 宮頸鱗癌組織中 β-catenin與 cyclinD1表達(dá)之間的關(guān)系

在宮頸鱗癌組織中 β-catenin與 cyclinD1共陽性表達(dá)有 21例,共陰性表達(dá)有 10例,β-catenin的異常表達(dá)與 cyclinD1的陽性表達(dá)呈正相關(guān) (r=0.885,P＜0.05,見表 3)。

表3 β-catenin與 cyclinD1在宮頸鱗癌中表達(dá)的相關(guān)性Table 3 Relationship between expression ofβ -catenin and cyclinD1 in squamous carcinoma of the uterine cervix

圖4 CyclinD1在 CIN組織中的表達(dá) (×400)Figure 4 Expression of cyclinD1 in CIN

圖5 CyclinD1在宮頸鱗癌組織中的表達(dá) (×400)Figur e 5 Overexpression of cyclinD1 in squamous cervical carcinoma

3 討論

宮頸癌是全球婦女中僅次于乳腺癌的第二大常見惡性腫瘤,在發(fā)展中國家女性中其發(fā)病率居第一,據(jù)世界范圍內(nèi)的統(tǒng)計(jì),每年大約有 50萬宮頸癌新發(fā)病例,占所有癌癥新發(fā)病例的 15%,因此研究多種腫瘤相關(guān)因子與宮頸癌發(fā)生與發(fā)展的關(guān)系尤為重要[1]。

惡性腫瘤的發(fā)生、浸潤和轉(zhuǎn)移涉及癌細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)相互作用的一系列復(fù)雜過程中細(xì)胞粘附是一個(gè)重要環(huán)節(jié)。βcatenin是一種多功能的胞漿蛋白,既能與 E-鈣粘素 (E-cadherin)組成復(fù)合體,又是 Wnt信號(hào)傳導(dǎo)通路的重要調(diào)控因子,參與細(xì)胞的生長分化、黏附、組織修復(fù)、腫瘤發(fā)生及轉(zhuǎn)移。正常情況下,β-catenin與 E-cadherin的胞漿部分形成 β-catenin/E-cadherin復(fù)合體,定位于細(xì)胞膜,維持上皮細(xì)胞的極性和完整性。在胞漿中 β-catenin的水平通過兩組蛋白質(zhì)的功能競爭來調(diào)節(jié):一組為破壞復(fù)合體,是由 GSK3、Axin及APC組成的一種較大的蛋白復(fù)合體,起破壞 β-catenin的作用,使其保持低水平,從而關(guān)閉 Wnt信號(hào)傳導(dǎo)通路;另一組為拮抗蛋白類,在對 Wnt信號(hào)反應(yīng)時(shí)被活化,起拮抗破壞復(fù)合體的作用,使 β-catenin的水平升高,開啟 Wnt信號(hào)傳導(dǎo)通路[2-3]。正常情況下,β-catenin在細(xì)胞內(nèi)保持低水平,Wnt信號(hào)傳導(dǎo)通路處于關(guān)閉狀態(tài)。cyclinD1是 Wnt信號(hào)傳導(dǎo)通路的下游靶基因之一[4]。當(dāng) Wnt/β-catenin途徑處于激活狀態(tài)時(shí),β-catenin蛋白在細(xì)胞質(zhì)及胞核中累積,作用于 cyclinD1啟動(dòng)子中 LEF-1結(jié)合位點(diǎn)而激活其轉(zhuǎn)錄,cyclinD1與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶 (cyclin dependent kinases,CDKs)結(jié)合并激活后者,誘導(dǎo)成人視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤易感基因 (Rb)產(chǎn)物的磷酸化。使 Rb與轉(zhuǎn)錄因子 E2F解離,游離的 E2F進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄,使細(xì)胞完成由 G1期到 S期的轉(zhuǎn)換進(jìn)入增殖階段[5]。目前已知人類多種惡性腫瘤中存在 Wnt/β-catenin通路激活。免疫組織化學(xué)研究已表明在宮頸鱗狀細(xì)胞癌中發(fā)現(xiàn) β-catenin和 cyclinD1的異常表達(dá)及高表達(dá)[6-10],但在 Wnt信號(hào)通路中,cyclinD1作為 β-catenin主要調(diào)節(jié)的靶基因,兩者在宮頸癌中表達(dá)的相關(guān)性尚不明確,未見相關(guān)報(bào)道。本研究對 42例宮頸鱗癌進(jìn)行了 β-catenin和 cyclinD1蛋白表達(dá)的相關(guān)性進(jìn)行了研究,以進(jìn)一步觀察 Wnt信號(hào)通路在該腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用。

本研究結(jié)果顯示:β-catenin及 cyclinD1在宮頸鱗癌中的異位表達(dá)及過表達(dá)分別達(dá) 64.3%及 61.9%,與其他文獻(xiàn)報(bào)道相似[6-10]。相關(guān)分析顯示兩者存在正相關(guān),且隨著正常宮頸組織→CIN→鱗癌的轉(zhuǎn)化,β-catenin及 cyclinD1的異常表達(dá)呈遞增趨勢,說明 Wnt/β-catenin通路的激活與宮頸鱗癌的發(fā)生密切相關(guān)。本結(jié)果還顯示了 β-catenin異位表達(dá)及 cyclinD1過表達(dá)與宮頸鱗癌的組織分級成正相關(guān),表明 β-catenin的異常表達(dá)可能與腫瘤的惡性行為和去分化有一定的關(guān)系,是腫瘤細(xì)胞獲得高增殖活性和侵襲性的原因之一。由于本組隨訪不全,未能做相關(guān)預(yù)后方面的統(tǒng)計(jì)分析。但有文獻(xiàn)顯示 βcatenin的異常表達(dá)與宮頸癌患者預(yù)后無關(guān)[10]。

但目前對 Wnt/β-catenin通路在宮頸癌中異常激活的具體環(huán)節(jié)尚不完全清楚。β-catenin基因在宮頸癌中突變率并不高,有報(bào)道為 17%甚至更低[11-12],說明 β-catenin基因突變可能僅在少數(shù)宮頸癌發(fā)生及發(fā)展中起作用。另有人研究發(fā)現(xiàn)APC啟動(dòng)子甲基化在宮頸癌中是一個(gè)頻繁事件,可能參與了Wnt/β-catenin信號(hào)通路異常激活[13-14]。

綜上所述,β-catenin及 cyclinD1在宮頸鱗癌中的異位表達(dá)及過表達(dá)分別達(dá) 64.3%及 61.9%,且隨著正常宮頸組織→CIN→鱗癌的轉(zhuǎn)化,β-catenin及 cyclinD1的異常表達(dá)呈遞增趨勢,β-catenin異位表達(dá)及 cyclinD1陽性表達(dá)均與宮頸鱗癌分化相關(guān),隨著宮頸癌的組織分級增高,β-catenin異位陽性表達(dá)、cyclinD1陽性表達(dá)逐漸增強(qiáng),但兩者均與淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移無關(guān)。以上結(jié)果表明 Wnt信號(hào)通路可能在宮頸發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。

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