宋波

(西華師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,四川南充637002)

1 引言

畜禽養(yǎng)殖環(huán)境污染深化是嚴(yán)重的社會(huì)問(wèn)題并逐漸受到人們的廣泛關(guān)注,我國(guó)集約化畜禽養(yǎng)殖業(yè)起步比較晚,但發(fā)展十分迅猛,養(yǎng)殖業(yè)一方面給廣大農(nóng)戶帶來(lái)豐厚的收入,但另一方面畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)排放的大量而集中的糞尿和廢水已成為許多城市和農(nóng)村的新污染源[1]。禽畜糞便已成為固體有機(jī)廢棄物的主要來(lái)源。不論是規(guī)?；酿B(yǎng)雞場(chǎng)還是散養(yǎng)的農(nóng)戶,隨著規(guī)模的不斷擴(kuò)大,雞糞的污染成了養(yǎng)雞業(yè)和農(nóng)戶最關(guān)心的問(wèn)題。雖然目前在盡力減少對(duì)環(huán)境造成的污染,但是在實(shí)際生產(chǎn)中不少養(yǎng)殖單位和農(nóng)戶在雞糞綜合利用上依然不盡人意,因此雞糞的處理和利用顯得尤為重要。國(guó)內(nèi)外的研究表明[2],雞糞中含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[3]。向雞糞中添加特定的微生物菌群,能有效地促進(jìn)有機(jī)物降解,加速雞糞腐熟進(jìn)程,同時(shí)還有利于消除致臭物質(zhì),減輕對(duì)環(huán)境的污染[4]。本實(shí)驗(yàn)從發(fā)酵雞糞中分離5株優(yōu)勢(shì)菌群,并對(duì)其生理生化特性進(jìn)行檢測(cè),旨在為雞糞資源的合理利用,生產(chǎn)高質(zhì)量的有機(jī)肥料奠定基礎(chǔ)。

2 材料與方法

2.1 實(shí)驗(yàn)材料

供試材料中的新鮮雞糞取自南充某養(yǎng)殖場(chǎng)。分離用培養(yǎng)基包括牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(分離細(xì)菌);20%雞糞抽提液加1.5%瓊脂(分離放線菌);PDA培養(yǎng)基(分離真菌)。搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基為20%的雞糞抽提液。

2.2 試驗(yàn)方法

2.2.1 菌株的分離純化

將新鮮雞糞用無(wú)菌水稀釋成濃度為10-2的溶液,采用平板稀釋法將雞糞涂抹在不同類(lèi)型的固體分離平板培養(yǎng)基上,置于30℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。3d后挑取分離平板上的單菌落,并進(jìn)一步采用平板稀釋分離法純化,然后將特征不同的菌落分別接種于相應(yīng)的斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng),并保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.2 菌種的篩選

將所有分離得到的菌株,以10%接種量接種到雞糞抽提液液體搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中(裝量100m L/500m L)100RPM培養(yǎng)。3d后接種劃線到相應(yīng)的平板上,培養(yǎng)2d后,挑取單菌落保存。

2.3 篩選菌株的生理生化鑒定

2.3.1 淀粉水解實(shí)驗(yàn)

將保存菌種逐個(gè)點(diǎn)種在淀粉水解培養(yǎng)基上,30℃培養(yǎng) 3d,滴入少量Lugol's碘液于平皿中,輕輕旋轉(zhuǎn)平板,使碘液均勻鋪滿整個(gè)平板。最后記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。若菌落周?chē)霈F(xiàn)無(wú)色透明圈,說(shuō)明淀粉被水解,透明圈的大小反映水解淀粉的能力。菌株水解能力以公式UP=(D/d)2計(jì)算。式中D為透明圈直徑(mm),d為菌落直徑。

2.3.2 酪素水解實(shí)驗(yàn)

分別挑取少許菌種,先接種含酪蛋白的斜面培養(yǎng)基,再點(diǎn)接于酪蛋白的平板,30～32℃培養(yǎng)24～48h,測(cè)定平板上菌苔直徑和水解圈的直徑[5]。

2.3.3 油脂水解實(shí)驗(yàn)

將溶化的固體油脂培養(yǎng)基冷卻至50℃左右時(shí),充分搖蕩使油脂分布均勻。無(wú)菌操作倒入平板,待凝。用記號(hào)筆在平板底部標(biāo)上菌名。然后將菌種用無(wú)菌操作劃成“十字”接種于平板的相對(duì)應(yīng)部分的中心。然后將平板倒置,于37℃溫箱中培養(yǎng)48h后,取出平板,觀察并記錄菌苔顏色,如出現(xiàn)紅色斑點(diǎn),為脂肪水解陽(yáng)性,記為“+”,否則為陰性,記為“-”。

2.3.4 產(chǎn)硫化氫實(shí)驗(yàn)

用接種針將菌種接種于醋酸鉛培養(yǎng)基中,置37℃培養(yǎng)48h。觀察并記錄顏色變化,出現(xiàn)黑色者為釋放硫化氫,深淺反映釋放的量[6]。

2.3.5 過(guò)氧化氫酶實(shí)驗(yàn)

將菌種接種于相應(yīng)的斜面培養(yǎng)基上,30℃培養(yǎng)24h。然后滴入3%H2O2數(shù)滴于斜面菌體上,若有氣泡為陽(yáng)性。

2.3.6 有機(jī)酸實(shí)驗(yàn)

將菌株分別接種到兩支葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基中,培養(yǎng)2d后,將1支葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基內(nèi)加入甲基紅試劑2滴,培養(yǎng)基變?yōu)榧t色者為陽(yáng)性,變黃色者為陰性,甲基紅試劑不宜加得太多,以免出現(xiàn)假陽(yáng)性[7]。

2.4 篩選菌株的形態(tài)鑒定

對(duì)篩選菌株的形態(tài)進(jìn)行鏡檢及染色分析,具體項(xiàng)目有革蘭氏染色、芽孢染色、鞭毛染色等。

2.5 菌株雞糞定殖試驗(yàn)

將適量發(fā)酵液與500g滅菌雞糞攪拌均勻,菌數(shù)控制在104個(gè)/g左右,控制水分在50%左右。裝入內(nèi)徑為8cm,深為12cm的滅菌陶土盆(底部通氣孔),上面罩以薄塑料(防止水分散發(fā)過(guò)快)。50℃恒溫發(fā)酵,間隔2d取樣,用稀釋平板法測(cè)定活菌數(shù)。

3 結(jié)語(yǔ)

通過(guò)本次實(shí)驗(yàn)從雞糞中篩選出5株菌株分別命名A 1～A 5,經(jīng)過(guò)鏡檢其中A 3為細(xì)菌,其余4株為酵母菌。

3.1 淀粉水解實(shí)驗(yàn)

5株菌株中有3株能分解淀粉,其中A 4菌株分解淀粉的能力最強(qiáng)UP值達(dá)到28,A 1和A 5菌株不具有分解淀粉的能力,見(jiàn)圖1。

圖1 不同菌株水解淀粉能力的 Up值比較

3.2 酪素水解實(shí)驗(yàn)

由圖2可知,A 3菌株和A 5菌株不具有分解酪素蛋白的能力,而其余3株均有降解酪素的能力,其分解能力的大小依次為A 4＞A 2＞A 1。

圖2 不同菌株水解酪素能力的 Up值比較

3.3 油脂水解實(shí)驗(yàn)

5株菌株中只有A 5菌株具有降解油脂的能力,占分離菌株的20%。

3.4 產(chǎn)硫化氫實(shí)驗(yàn)

所分離的5株菌株,都能不同程度產(chǎn)生硫化氫。根據(jù)產(chǎn)生硫化氫的深淺判斷產(chǎn)生硫化氫的能力為：A 3＞A 1＞A 5＞A 2＞A 4。

3.5 過(guò)氧化氫酶實(shí)驗(yàn)

分離的5株菌株中,有2株微生物能分解過(guò)氧化氫,分別是A 2和A 3.占分離菌株的40%。

3.6 有機(jī)酸實(shí)驗(yàn)

在分離的5株菌株中,A3菌株具有加入甲基紅以后培養(yǎng)基變紅,呈陽(yáng)性,說(shuō)明其具有產(chǎn)有機(jī)酸的能力。

菌株在雞糞中的定殖試驗(yàn)結(jié)果5個(gè)菌株在雞糞中的定殖試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。各菌株在接種第4d至第6d菌數(shù)增加最快,這與雞糞堆肥從第4d進(jìn)入高溫期第7d降溫相一致。在這期間雞糞化學(xué)成分發(fā)生很大變化,是有機(jī)物降解、除臭和脫水的關(guān)鍵時(shí)期。其中菌株A 1、A 2、A 4菌數(shù)增長(zhǎng)較快。

表1 菌株在雞糞中的定殖試驗(yàn)結(jié)果

4 結(jié)語(yǔ)

本試驗(yàn)從自然雞糞堆肥中分離篩選出5株優(yōu)勢(shì)菌,分別對(duì)5株菌進(jìn)行淀粉水解實(shí)驗(yàn)、酪素蛋白水解實(shí)驗(yàn)、定植實(shí)驗(yàn)等其中A 4株細(xì)菌具有較強(qiáng)的分解蛋白能力,并且能在雞糞中很好地定殖,是比較理想的雞糞發(fā)酵菌株。在進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)中,可以將該菌株進(jìn)行發(fā)酵雞糞實(shí)驗(yàn),以便對(duì)雞糞的加工處理做出更加合理高效的改進(jìn)。

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