趙 強(qiáng), X.Chris LE(樂(lè)曉春)

(1.山西大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程研究中心,山西太原 030006; 2.U niversity of A lberta,Edm onton,Canada T6G2G3)

作為本期《色譜》的聚焦專欄評(píng)述,筆者主要介紹國(guó)內(nèi)外學(xué)者在 2010年 3月和 4月間發(fā)表的一些研究工作[1-9],內(nèi)容集中在色譜研究和應(yīng)用的兩個(gè)方面:新型色譜材料和方法技術(shù)的開發(fā)[1-5];色譜在蛋白質(zhì)組學(xué)分析中的新應(yīng)用[6,7]。另外,近期也有不少關(guān)于微流控分析應(yīng)用的具有特色的工作[8],由于篇幅限制就不在這里詳細(xì)介紹。

1 交替共聚物反相色譜分離同分異構(gòu)體

同分異構(gòu)體的結(jié)構(gòu)類似,但常常表現(xiàn)出不同的物理化學(xué)性質(zhì)和生物活性,如何有效分離同分異構(gòu)體是分析化學(xué)工作者面臨的眾多挑戰(zhàn)之一。交替共聚物是兩種單體單元在高分子鏈上嚴(yán)格交替排列 (相間排列)的一種聚合物。采用具有相應(yīng)官能團(tuán)的單體分子,交替共聚物可以使具有某種弱相互作用性質(zhì)的官能團(tuán)沿高分子主鏈定向排列,利用這種特殊的交替結(jié)構(gòu),可與分析物產(chǎn)生多位點(diǎn)相互作用,因而可作為色譜固定相用于多種同分異構(gòu)體的高選擇性分離。日本 Kum am oto大學(xué)的 Ihara教授研究小組[1]采用高分子交替聚合物反應(yīng),將丙烯酸十八醇酯和 N-十八烷基馬來(lái)酰亞胺的交替共聚物嫁接在二氧化硅上,制成用于色譜分離的固定相。通過(guò)增強(qiáng)的π-π相互作用和偶極相互作用,這種新型固定相具有獨(dú)特的空間結(jié)構(gòu)選擇性,使其區(qū)別于傳統(tǒng)的 C18反相色譜固定相。利用這種新型的色譜固定相,該研究小組實(shí)現(xiàn)了多環(huán)芳烴化合物的等度洗脫分離,實(shí)現(xiàn)了對(duì) 16種多環(huán)芳烴標(biāo)準(zhǔn)品混合物的分離。β-胡蘿卜素和生育酚(維生素 E)具有重要的生物功能,分離它們的同分異構(gòu)體具有重要的生物學(xué)意義。然而這兩種物質(zhì)的同分異構(gòu)體在傳統(tǒng)的反相色譜柱上很難實(shí)現(xiàn)分離,但在以高分子交替共聚物固定相制成的色譜柱上兩者的同分異構(gòu)體都得到了高效的分離,其中β-生育酚和γ-生育酚的基線分離還是第一次報(bào)道。這種新型固定相在分離中所具有的高選擇性主要?dú)w結(jié)于兩個(gè)方面:丙烯酸十八醇酯和N-十八烷基馬來(lái)酰亞胺的交替共聚物填料提供了豐富的羰基官能團(tuán),使得羰基和π共軛體系的相互作用得到增強(qiáng);長(zhǎng)烴基碳鏈的相對(duì)有序性提供了利于分子間多點(diǎn)π-π相互作用的微環(huán)境。

2 具有亞微米級(jí)塔板高度的二氧化硅膠體晶毛細(xì)管電色譜

根據(jù)Van D eem ter的速率理論,采用小粒徑顆粒(例如 2μm硅膠顆粒)作為反相色譜填料,可以有效提高分離效率和提升分離速度。然而,由于減小固定相填充物的粒徑會(huì)導(dǎo)致色譜柱填充的不均一性,增大了渦流擴(kuò)散項(xiàng) (A),從而影響色譜柱的分離效率。二氧化硅膠體晶可以自組裝形成面心立方點(diǎn)陣的緊密堆積,且排布非常均一,可以被用作分離介質(zhì)。最近,Purdue大學(xué)的W irth教授研究小組[2]在直徑為 330nm的二氧化硅膠體表面上修飾了含 18個(gè)碳的飽和烷基鏈,然后將其填充到毛細(xì)管中制成色譜柱,整個(gè)填充過(guò)程并不需要利用壓力,只需將毛細(xì)管浸到二氧化硅膠體顆粒的懸浮液中,借助毛細(xì)作用就可實(shí)現(xiàn)。由于膠體晶的緊密堆積,所填充的毛細(xì)管柱可以不用在柱端制備塞子(內(nèi)徑為 100μm的這種硅膠晶體填充柱可以承受至少 85.4M Pa(12 400psi)的柱壓)。光學(xué)顯微圖像中的布拉格衍射、掃描電鏡結(jié)果和測(cè)定的孔隙率都表明毛細(xì)管內(nèi)的硅膠顆粒自組裝形成面心立方晶體點(diǎn)陣緊密堆積,整個(gè)填充柱具有晶體的高度有序特性,這與傳統(tǒng)的填充柱顯著不同。研究者應(yīng)用細(xì)胞膜紅色探針 D iI(1,1-didodecyl-3,3,3,3-tetram ethyl-indocarbocyanine perchlorate)對(duì)這種新型填充色譜柱的分離效果進(jìn)行了詳細(xì)的測(cè)評(píng)。結(jié)果表明其塔板高度為 0.23μm,折合板高僅為 0.7,渦流擴(kuò)散項(xiàng)A=(0 ±20)nm。該研究證實(shí)提高色譜柱填充的均一性可以有效地提高小粒徑填料色譜柱的分離效率。

最近,加拿大 A lberta大學(xué)的 Harrison小組[3]將二氧化硅膠體晶自組裝在微流控通道中用于分離脫氧核糖核酸(DNA)。膠體晶的緊密堆積形成高度有序的納米孔陣列,當(dāng)采用直徑 100nm的硅膠顆粒時(shí),納米孔徑大小可以降至 15nm,小于DNA的構(gòu)象保持長(zhǎng)度(50nm)。在非對(duì)稱脈沖電場(chǎng)電泳模式下,他們研究了DNA在這種高度有序的納米孔陣列中的動(dòng)力學(xué)行為和 DNA分離機(jī)理,發(fā)現(xiàn)當(dāng)納米孔的空間限制小于DNA的構(gòu)象保持長(zhǎng)度時(shí),DNA在分離過(guò)程中處于完全伸展的構(gòu)象,可以提高分離效率。

3 乳膠納米顆粒作為準(zhǔn)固定相的膠束電動(dòng)色譜新方法

日本的 Tarabe教授發(fā)明的膠束電動(dòng)色譜法,通過(guò)引入準(zhǔn)固定相,可以用于分離離子和非離子的化合物,其應(yīng)用廣泛。最近,澳大利亞 Tasm ania大學(xué)的 Palm er和 Haddad小組[4]將直徑為 63nm的乳膠顆粒作為電動(dòng)色譜的準(zhǔn)固定相,發(fā)明了一種新型膠束電動(dòng)色譜分離法。納米乳膠顆粒通過(guò)乳液聚合反應(yīng)合成得到。這種合成的乳膠納米顆粒具有疏水的核和帶有離子的殼層。通過(guò)疏水相互作用,乳膠納米顆粒體可以對(duì)分析物進(jìn)行分離。由于乳膠納米顆粒對(duì)于紫外檢測(cè)、分離電流、質(zhì)譜接口、離子化效率沒(méi)有顯著影響,因而紫外和質(zhì)譜都可以作為這種新型電動(dòng)色譜的檢測(cè)器。利用電動(dòng)色譜的 Sw eep ing功能,可以實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品的富集,特別是對(duì)疏水性樣品,采用質(zhì)譜檢測(cè),檢出限可以降至 10×10-9(10ppb)。

4 納米金修飾的高分子整體柱用于捕獲和分離含硫醇的多肽

蛋白質(zhì)組分析中降低樣品的復(fù)雜性一直是重要的研究課題。納米金可以與硫醇反應(yīng),利用這一反應(yīng)特性,美國(guó) California大學(xué) B erkeley分校的 Fréchet教授研究小組[5]最近將金納米粒子修飾到高分子整體柱的表面,制備了一種新型的色譜固定相,其可以選擇性地捕獲含有半胱氨酸的多肽,從而降低蛋白質(zhì)組bottom-up(自下而上)定量分析法中多肽混合物的復(fù)雜性。制備納米金修飾的整體柱時(shí),首先將半胱胺與高分子整體柱表面的基團(tuán)反應(yīng),使整體柱表面衍生上硫醇官能團(tuán);然后在整體柱上原位還原氯金酸,生成金納米粒子;最后金納米粒子與整體柱表面的硫醇反應(yīng)而固定在整體柱上。雖然修飾了金納米粒子,但這種新型的色譜固定相仍然保留了高分子整體柱優(yōu)良的流體力學(xué)特性。含有半胱氨酸的多肽,由于自由硫醇官能團(tuán)與納米金表面有很強(qiáng)的親和力,因而被保留,從而實(shí)現(xiàn)與其他多肽的分離;被保留的多肽可以通過(guò) 2-巰基乙醇將其從納米金上洗脫。

5 集在線進(jìn)樣、樣品同位素標(biāo)記和多維分離為一體的全自動(dòng)蛋白質(zhì)組定量分析技術(shù)

采用液相色譜結(jié)合串聯(lián)質(zhì)譜對(duì)蛋白質(zhì)組進(jìn)行定量分析在生物研究和疾病診斷中具有重要的意義。定量分析中對(duì)樣品進(jìn)行同位素標(biāo)記可以保證質(zhì)譜測(cè)定的準(zhǔn)確性,但往往增加了分析過(guò)程的復(fù)雜性。中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所的鄒漢法教授研究小組[6]發(fā)展了一種全自動(dòng)化系統(tǒng),實(shí)現(xiàn)了對(duì)蛋白質(zhì)組樣品的在線進(jìn)樣、樣品的在線二甲基同位素標(biāo)記和在線多維分離。該系統(tǒng)主要包括自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)、14cm長(zhǎng)的兩相捕獲柱(7cm的 C18反相色譜填充柱和 7cm的強(qiáng)陽(yáng)離子交換色譜整體柱)、轉(zhuǎn)換閥、15cm長(zhǎng)的 C18反相色譜分離柱和質(zhì)譜儀。測(cè)定中,樣品在兩相柱中的反相色譜柱部分完成富集和在線同位素標(biāo)記,在兩相柱中的強(qiáng)陽(yáng)離子交換色譜柱部分和反相色譜分離中實(shí)現(xiàn)在線多維分離,最后進(jìn)入質(zhì)譜儀進(jìn)行測(cè)定。這種新型蛋白質(zhì)組分析技術(shù)具有全自動(dòng)化、分離分析快速、樣品用量少、蛋白質(zhì)覆蓋率大和靈敏度高等特點(diǎn),提高了定量分析的重現(xiàn)性和準(zhǔn)確性。1 000多種蛋白質(zhì)的定量分析可以在 30h內(nèi)完成,蛋白質(zhì)樣品用量?jī)H需 30μg。他們采用這種全自動(dòng)分析技術(shù)分析檢測(cè)了肝癌細(xì)胞和正常肝組織細(xì)胞的蛋白質(zhì)表達(dá)的差異性,結(jié)果表明 94種蛋白質(zhì)具有上調(diào)性,而 249種蛋白質(zhì)具有下調(diào)性。

最近兩個(gè)月國(guó)際上有很多出色的研究論文發(fā)表[1-9]。為了保持《色譜》前面 4期聚焦專欄的風(fēng)格[10-13],在本期的專欄中筆者只是從中選擇了幾篇有代表的論文進(jìn)行評(píng)述,以饗讀者。

[1] M allik A K,Saw ada T,TakafujiM,et al.Anal Chem,2010,82:3320

[2] M alkin D S,W ei B,Fogiel A J,et al.Anal Chem,2010,82:2175

[3] Nazem ifard N,Bhattacharjee S,M asliyah J H,et al.Angew Chem Int Ed,2010,49:1

[4] Palm er C P,Hilder E F,Quirino J P,et al.Anal Chem,DO I:10.1021ac902922u,Published Online Ap ril19,2010

[5] Xu Y,Cao Q,Svec F,et al.Anal Chem,2010,82:3352

[6] W ang F,Chen R,Zhu J,et al.Anal Chem,2010,82:3007

[7] Xue H,LüB,Zhang J,et al.J Proteom e Res,2010,9:545

[8] Zeng Y,Novak R,Shuga J,et al.Anal Chem,2010,82:3183

[9] W oodw ard S D,U rbanova I,Nurok D,et al.Anal Chem,2010,82:3445

[10] Zou H F.Chinese Journal of Chrom atography(鄒漢法.色譜),2010,28(1):100

[11] Liu H W.Chinese Journal of Chrom atography(劉虎威.色譜),2010,28(2):221

[12] Kang J W.Chinese Journal of Chrom atography(康經(jīng)武.色譜),2010,28(3):223

[13] Yan C.Chinese Journal of Chrom atography(閻超.色譜),2010,28(4):327