王緒偉 ,李戰(zhàn)華

(中國科學(xué)院力學(xué)研究所非線性力學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京100190)

0 引 言

MPT(Multiple-Particle Tracking)也叫多粒子追蹤,是測量粒子布朗運(yùn)動(dòng)的一種方法,其原理是連續(xù)記錄多個(gè)粒子的運(yùn)動(dòng)圖像,通過圖像處理獲取粒子布朗運(yùn)動(dòng)位移。粒子布朗運(yùn)動(dòng)曾被用于測量Avogadro常數(shù)、Boltzmann常數(shù)等[1-2],近來用于測量細(xì)胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)和流變特性等[3-4],因此MPT方法在膠體科學(xué)和生物細(xì)胞研究等領(lǐng)域有重要的應(yīng)用前景。

MPT方法包括圖像采集和圖像處理兩個(gè)部分。圖像采集是利用CCD連續(xù)記錄粒子運(yùn)動(dòng)圖像。圖像處理可細(xì)分為：圖像濾波、粒子識(shí)別、粒子匹配和擴(kuò)散系數(shù)計(jì)算4個(gè)步驟[5-6]。圖像濾波是為了消除粒子圖像中的背景灰度不均勻和單點(diǎn)噪聲。粒子識(shí)別是為了提取光斑位置。粒子匹配是對(duì)相鄰兩幀圖像上的粒子進(jìn)行配對(duì),判斷粒子同一性,以便計(jì)算其位移。

目前MPT圖像處理中大多使用Crocker[5]給出的圖像處理算法。粒子識(shí)別環(huán)節(jié)是圖像處理的關(guān)鍵,通常采用的單一灰度閾值在識(shí)別粒子凝聚團(tuán)、粒子的衍射光暈等時(shí)會(huì)出現(xiàn)錯(cuò)誤。為了剔除“偽粒子”,Crocker[5]曾提出了利用粒子光斑一階矩和二階矩的散點(diǎn)圖,將圖中零零散散的光斑予以剔除。Sbalzarini[7]對(duì)錯(cuò)點(diǎn)剔除辦法進(jìn)行了改進(jìn),提出了選擇剔除粒子量化公式。改進(jìn)后可以有效剔除粒徑過大或形狀不規(guī)則的粒子,如聚集狀態(tài)的粒子團(tuán)。Patrik[8]根據(jù)離焦平面越遠(yuǎn)粒子衍射圖像越大的原理,提出了剔除非焦平面粒子的辦法,即以粒子光斑的直徑為閾值,濾除偏離焦平面的光斑過大的粒子,并用0.925μ m粒子驗(yàn)證了此方法有效性。但這一技術(shù)僅剔除非焦平面的粒子,并未包括光斑是否代表真實(shí)粒子的判斷。由于納米粒子粒徑小、光強(qiáng)弱,實(shí)驗(yàn)中通常要使用高倍數(shù)的物鏡和高靈敏度的EMCCD。高倍數(shù)的物鏡焦平面較薄,粒子容易形成光暈;而高靈敏度的EMCCD有利于采集微弱的光強(qiáng)信號(hào),但當(dāng)粒子光斑和光暈的灰度差別不大時(shí),二值化處理中粒子圖像中的衍射光暈容易離散化形“偽粒子”,因此需要探索新的粒子識(shí)別方法。此外,MPT程序中,粒子匹配結(jié)果的正確性一直是大家關(guān)心卻不能妥善解決的問題。一種辦法是使用數(shù)值算法生成模擬粒子運(yùn)動(dòng)軌跡和圖像序列,然后用實(shí)驗(yàn)程序追蹤模擬粒子圖像,并與已知的粒子運(yùn)動(dòng)軌跡進(jìn)行比較[4]。但是對(duì)模擬粒子圖像的追蹤效果并不能完全代表對(duì)真實(shí)圖像的處理,而且該方法并不能直觀地標(biāo)記追蹤中發(fā)生錯(cuò)誤的位置和錯(cuò)誤的原因,不利于針對(duì)錯(cuò)誤原因改進(jìn)算法。

因此,通過測量直徑200nm的熒光粒子在純水中的布朗運(yùn)動(dòng),在開發(fā)粒子追蹤程序中研究納米粒子光斑識(shí)別和匹配效果的可視化技術(shù)。通過調(diào)整灰度閾值比較粒子光斑面積變化進(jìn)行“偽粒子”剔除。為了比較手動(dòng)與程序追蹤的粒子匹配效果,提出矢量判別法顯示粒子匹配效果。通過測量φ 200nm粒子擴(kuò)散系數(shù)驗(yàn)證粒子追蹤法的有效性。

1 實(shí)驗(yàn)與圖像處理方法

實(shí)驗(yàn)在中物院力學(xué)所 LNM室進(jìn)行。采用O-lympus IX71倒置熒光顯微鏡,配有NA=1.35的100倍油鏡進(jìn)行觀測。圖像采集使用Andor iXon885 EMCCD,在bing 2模式下為501×502像素,像素尺寸為160nm/像素。實(shí)驗(yàn)用粒子為200nm直徑的聚苯乙烯熒光粒子(Duke Scientific),熒光的吸收和發(fā)射波長分別為532nm和615nm。實(shí)驗(yàn)時(shí),熒光粒子在超純水中稀釋至體積分?jǐn)?shù)約為10-5。

實(shí)驗(yàn)溶液配置后的5～10min內(nèi)開始實(shí)驗(yàn)。將約50μ L含納米熒光粒子的溶液滴到蓋玻片上,如圖1,液滴的直徑約3mm。CCD焦平面調(diào)至距離玻片上表面約10μ m。圖像采集時(shí)連續(xù)兩幀的時(shí)間間隔Δ t為36.5ms,其中包括圖像曝光時(shí)間約10ms和圖像傳輸時(shí)間。在同一位置連續(xù)拍攝200幀圖像。用4個(gè)液滴重復(fù)上述實(shí)驗(yàn),每次實(shí)驗(yàn)持續(xù)時(shí)間為20～25min。實(shí)驗(yàn)溫度在20～23℃±0.1℃,單次實(shí)驗(yàn)過程中溫度變化小于±0.3℃。

圖1 實(shí)驗(yàn)裝置示意圖Fig.1 Schematic of the experimental setup

用手動(dòng)追蹤和MPT程序追蹤分別進(jìn)行圖像處理。手動(dòng)追蹤是指人工進(jìn)行粒子定位和匹配。對(duì)連續(xù)兩幀圖像進(jìn)行粒子配對(duì)后得到多個(gè)粒子的單步位移Δx,然后對(duì)連續(xù)200幀圖像進(jìn)行同樣的處理,獲得多個(gè)粒子的連續(xù)位移。根據(jù)Einstein公式,單個(gè)粒子運(yùn)動(dòng)的二維均方位移為

其中Δx為間隔時(shí)間Δt內(nèi)粒子的單步位移。對(duì)多個(gè)粒子的均方位移采用系綜平均計(jì)算,得到實(shí)驗(yàn)擴(kuò)散系數(shù)Dexp為

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 粒子識(shí)別的錯(cuò)點(diǎn)剔除技術(shù)

對(duì)點(diǎn)光源進(jìn)行成像時(shí),由于散射和鏡頭球差的存在,成像光斑為一個(gè)圓斑和一個(gè)同心圓環(huán)的光暈。偏離焦平面中央的熒光納米粒子光斑外有明顯的光暈。MPT方法處理時(shí),首先設(shè)定灰度閾值將圖像轉(zhuǎn)換為二值化圖像。部分帶光暈的光斑經(jīng)過二值化轉(zhuǎn)換后,光暈被離散成多個(gè)片段,如圖2(a)。在粒子識(shí)別時(shí),這些光暈片段被當(dāng)作粒子光斑,形成“偽粒子”。由于納米粒子成像時(shí),本身光斑直徑較小,亮度較低,使用現(xiàn)有的基于光斑形態(tài)和灰度大小的算法很難有效剔除這類“偽粒子”。

我們發(fā)現(xiàn),假設(shè)在圖像二值化時(shí)所使用的灰度閾值改變量為 Δ G,粒子光斑和光暈的面積都有變化,但粒子光暈片段在低灰度閾值下相互連通,導(dǎo)致其面積變化Δ Sc比粒子光斑的面積變化Δ Sp更明顯。圖2(b)顯示,當(dāng) ΔG變化3%后,ΔSp≈20像素,而 ΔSc≈200像素。利用這一現(xiàn)象,在二值化過程中調(diào)整灰度閾值并檢測光斑面積變化,就可以有效地剔除“偽粒子”。

圖2 圖像二值化中不同灰度閾值時(shí)粒子光斑與光暈的面積變化Fig.2 The area varieties of one particle spot and its diffraction rings under different grayscale thresholds

2.2 粒子匹配的矢量判別法

對(duì)實(shí)驗(yàn)拍攝的圖像分別采用手動(dòng)追蹤和程序追蹤。將相鄰兩幀圖像中粒子匹配的結(jié)果以箭頭形式繪制,其中箭頭的起點(diǎn)為粒子起始位置,箭頭的大小和方向代表該粒子在Δ t時(shí)間內(nèi)的單步位移,如圖3。布朗運(yùn)動(dòng)是隨機(jī)的,因此矢量的方向任意,但矢量的大小可由已知粒子直徑代入Einstein-Stokes公式進(jìn)行估計(jì),因此矢量大小直觀地顯示了可能發(fā)生錯(cuò)誤匹配的位置。假設(shè)手動(dòng)追蹤的矢量場可靠,程序追蹤與手動(dòng)追蹤矢量圖的夾角也提示用軟件進(jìn)行粒子匹配可能發(fā)生錯(cuò)誤,從而為改進(jìn)MPT算法提供依據(jù)。根據(jù)公式(1),φ 200nm粒子的平均位移大小為4～5像素,而通常引起偽粒子識(shí)別的光暈距離粒子光斑中心為5像素以上,因此MPT程序的偽粒子識(shí)別將引起矢量夾角大于60°。當(dāng)調(diào)整程序追蹤中使用的灰度閾值到2%后,所得到的矢量與手動(dòng)追蹤的矢量圖基本相同,有一對(duì)錯(cuò)誤,如圖3(a),圖中較小的矢量夾角是由于手動(dòng)和程序追蹤使用了不同亞像素算法引起的。此外,粒子識(shí)別時(shí)的灰度閾值高低影響被追蹤的粒子個(gè)數(shù)。高閾值(如5%),圖3(b)未發(fā)現(xiàn)程序匹配錯(cuò)誤,但部分粒子沒有被程序識(shí)別。此結(jié)果也說明矢量法還可以直觀判斷圖像識(shí)別時(shí)選擇的閾值的效果。正是分析圖3(a)中的錯(cuò)誤匹配的粒子光斑,才發(fā)現(xiàn)了由于光暈引起的“偽粒子”問題。

2.3 錯(cuò)點(diǎn)剔除算法驗(yàn)證

圖3 粒子匹配手動(dòng)追蹤(綠色)和程序追蹤(紅色)的粒子矢量位移比較Fig.3 Displacement vercors of the track results by MPT program(red)and by hand(green)

圖4 手動(dòng)追蹤和程序追蹤給出的φ 200nm粒子實(shí)驗(yàn)擴(kuò)散系數(shù)測量結(jié)果的比較(橫坐標(biāo)為實(shí)驗(yàn)日期)Fig.4 The experimental diffusion coefficients of 200nm particles measured with MPT and by hand

為了驗(yàn)證2.1節(jié)提出的光斑錯(cuò)點(diǎn)剔除法和2.2節(jié)的粒子匹配矢量法,我們對(duì)φ 200nm粒子進(jìn)行擴(kuò)散系數(shù)測量實(shí)驗(yàn)。圖像處理分別使用手動(dòng)追蹤和程序追蹤,然后利用公式(2)計(jì)算實(shí)驗(yàn)擴(kuò)散系數(shù)。對(duì)4次實(shí)驗(yàn),程序中不含有錯(cuò)點(diǎn)剔除算法時(shí),追蹤結(jié)果與手動(dòng)追蹤相比偏差很大約為8%～13%,如圖4(a);程序包含錯(cuò)點(diǎn)剔除算法后的實(shí)驗(yàn)擴(kuò)散系數(shù)基本與手動(dòng)追蹤的結(jié)果相同,如圖4(b),4次試驗(yàn)中的3次中二者偏差不到2%,另外一次的偏差也降低為8%。

由于實(shí)驗(yàn)拍攝的粒子圖像并不完全相同,因此每批實(shí)驗(yàn)圖像應(yīng)該先選取一些使用手動(dòng)追蹤。然后用MPT程序處理與手動(dòng)結(jié)果比較,對(duì)灰度閾值進(jìn)行選擇使二者結(jié)果一致,再用程序代替手動(dòng)追蹤。

3 結(jié) 論

采用MPT方法測量200nm直徑的粒子在純水中的擴(kuò)散系數(shù),在手動(dòng)追蹤粒子位移的同時(shí)自主開發(fā)了程序,發(fā)現(xiàn)現(xiàn)有MPT方法缺乏對(duì)粒子匹配效果的直觀顯示,影響對(duì)匹配算法的改進(jìn),而且納米粒子光暈會(huì)影響粒子識(shí)別,因此提出下述改進(jìn)技術(shù)：

(1)在粒子識(shí)別過程中,調(diào)節(jié)灰度閾值并檢測粒子光斑面積變化,基于光斑及光暈的面積對(duì)閾值的敏感性可以有效地剔除光暈類“偽粒子”;

(2)在粒子匹配過程中,將連續(xù)兩幀中粒子位移用矢量表示,可以直觀顯示MPT方法中粒子匹配效果。

φ 200nm粒子擴(kuò)散系數(shù)測量的實(shí)驗(yàn)表明,在MPT方法中增加上述粒子識(shí)別法手動(dòng)追蹤和程序追蹤獲得的實(shí)驗(yàn)擴(kuò)散系數(shù)的偏差由8%～13%減小為2%～8%,這表明使用基于光斑面積閾值敏感性的算法來剔除光暈引起的“偽粒子”是合理、有效的。

[1]PERRIN J B.Atoms,2nd English edition[M].London：Constable,1923.

[2]NAKROSHIS P,AMOROSO M,LEGERE J,et al.Measuring Boltzmann's constant using video microscopy of Brownian motion[J].Am.J.Phys.,2003,71(6)：568-573.

[3]LIU J,GARDEL M L,KROY K,et al.Microrheology probes length scale dependent rheology[J].Physical Review Letter,2006,96：118104.

[4]SERGE A,BERTA UX N,RIGNEA ULT H,et al.Dynamic multiple-target tracing to probe spatiotemporal cartography of cell membranes[J].Nature Methods,2008,5(8)：687-694.

[5]CROCKER J C,GRIER D G.Methods of digital video microscopy for colloidal studies[J].Journal of Colloid and Interface Science,1996,179(1)：298-310.

[6]王緒偉,李戰(zhàn)華.SPT方法在納米粒子布朗運(yùn)動(dòng)觀測中的應(yīng)用[J].實(shí)驗(yàn)流體力學(xué),2008,22(1)：84-87.

[7]SBALZARINI I F,KOUMOUTSAKOS P.Feature point tracking and trajectory analysis for video imaging in cell biology[J].Journal of Structural Biology,2005,151：182-195.

[8]SAVIN T,SPICER P T,DOYLE P S.A rotional approach to noise discrimination in video microscopy particle tracking[J].Applied Physics Letters,2008,93：024102.

[9]EINSTEIN A.Investigations on the theory of the Brownian movement[M].Dover Publishing,INC.,1956.