劉晶，宋琳，鄒偉，諸葛棟，崔占峰

1 大連醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 中英再生醫(yī)學應(yīng)用研究中心，大連 116011

2 Department of Engineering Science, University of Oxford, Oxford OX1 3PJ, U. K.

3大連理工大學環(huán)境與生命學院，大連 116024

4 遼寧師范大學生命科學學院，大連 116029

長期以來，多種難治性疾病如中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心血管系統(tǒng)疾病、糖尿病及自身免疫系統(tǒng)疾病等嚴重威脅著人類的健康與生命，徹底治療這些疾病是人類一直未能解決的健康難題[1]。1988年世界第一株人胚胎干細胞 (Embryonic stem cells，ESCs)系建立，其后成體干細胞的研究突飛猛進，隨著該領(lǐng)域研究的深入，有關(guān)間充質(zhì)干細胞 (Mesenchymal stem cells，MSCs) 治療疾病的基礎(chǔ)和臨床研究更是顯示出了令人欣慰的前景[2-3]，MSCs移植有望成為難治性疾病最有前途的治療策略。MSCs來源于多種組織，包括骨髓、臍帶血、外周血、脂肪等，但無論哪一種來源，其取材數(shù)量都是有限的，很難滿足臨床移植所需的細胞數(shù)量要求。因此科學家開始探討體外擴增技術(shù)，以提高干細胞數(shù)量，現(xiàn)已能在體外實現(xiàn)數(shù)倍至數(shù)十倍擴增不等，從技術(shù)上保證了MSCs作為移植種子細胞的數(shù)量要求。但在其應(yīng)用于臨床之前，首當其沖就是要確保其在體內(nèi)的功能有效性及移植安全性，本文就體外擴增間充質(zhì)干細胞應(yīng)用于臨床的有效性及安全性研究進展作一綜述。

1 MSCs體外擴增的研究現(xiàn)狀

雖然MSCs在臨床治療上的前景和地位已經(jīng)明確，但由于人體內(nèi)干細胞來源數(shù)量有限，僅靠傳統(tǒng)培養(yǎng)的方法難以在短時間內(nèi)滿足臨床移植上對細胞數(shù)量的要求。因此，MSCs的體外擴增方法的探索一直是干細胞研究領(lǐng)域的熱點問題。國內(nèi)外已竟相開展這方面研究工作，取得了一些進展。目前較為成功的擴增方法是通過生物反應(yīng)器實現(xiàn)干細胞擴增。Chen等[4]利用旋轉(zhuǎn)式生物反應(yīng)器擴增人骨髓 MSCs，另外添加干細胞因子 (Stem cell factor，SFC)、白細胞介素-3 (Interleukin-3，IL-3) 和 IL-6，檢測發(fā)現(xiàn) Stro-1+ CD44+CD34-的MSCs在8 d后可擴增9倍，成纖維細胞集落形成率 (Colony-forming efficiency-fibroblast per day，CFE-F/day) 是未用生物反應(yīng)器擴增的對照組的1.44倍，擴增后的細胞可表達間充質(zhì)干細胞早期標志波形蛋白 (Vimentin) 和Endoglin (SH2)，而分化細胞的標志如II型膠原、骨鈣素 (Osteocalcin， OC) 和C/EBP-α等則未檢測到，并且這些細胞可分化為成骨細胞、成軟骨細胞及成脂肪細胞。本課題組也利用生物反應(yīng)器成功在體外擴增出MSCs，如利用攪拌式生物反應(yīng)器培養(yǎng)人胎盤來源的MSCs，與用培養(yǎng)皿擴增的對照組細胞相比較，培養(yǎng)144 h后攪拌式生物反應(yīng)器擴增的細胞數(shù)量是培養(yǎng)皿的 1.73倍，并且 MSCs的表型特征不變[5]。通過氣升式環(huán)流中空纖維膜生物反應(yīng)器對兔骨髓MSCs進行三維動態(tài)培養(yǎng)，7 d后可擴增16倍，擴增后大部分細胞呈CD29+、CD44+、CD45-，保持MSCs的表型，并具有較強的成骨、成軟骨和成脂的多向分化能力[6]。這些研究表明，通過生物反應(yīng)器不但可使MSCs在數(shù)量上得到擴增，還能夠保證MSCs維持原本的表型和分化能力，符合臨床移植用MSCs的基本生物學特征。

除了生物反應(yīng)器，科學家們還發(fā)現(xiàn)了其他方法也有助于實現(xiàn)MSCs體外擴增。研究發(fā)現(xiàn)通過表面抗原篩選可以提高MSCs擴增效率。一般認為間充質(zhì)干細胞的表面抗原情況與造血干細胞相反，即CD31、CD34為陰性，CD29、CD44、CD71、CD90、CD105、CD106、CD271等為陽性。根據(jù)這一特性，Jarocha等[7]通過免疫磁珠分離純化CD105+CD271+的人骨髓MSCs并擴增，表達CD105和CD271的成纖維細胞集落生成單位 (Colony-forming unitfibroblastic，CFU-F) 是未純化細胞的3~4倍。此外，其他一些影響MSCs體外擴增的因素也陸續(xù)被報道。有研究者通過改善培養(yǎng)基質(zhì)實現(xiàn)MSCs的體外擴增，Zangi等[8]用纖維蛋白微珠可有效將MSCs從大鼠骨髓中分離并且擴增。Kocaoemer等[9]用人AB血清和凝血酶激活的富含血小板血漿 (Thrombin-activated platelet-rich plasma) 分別作為擴增用血清，對人脂肪來源的MSCs進行擴增，結(jié)果表明第6代MSCs的擴增倍數(shù)分別為66.6±15.7和68.1±6.7，而用胎牛血清擴增的倍數(shù)僅為 24.4±0.7。除基質(zhì)材料與血清的優(yōu)化外，一些生長因子也有利于MSCs的擴增。如Tamama等[10]證實表皮細胞生長因子 (Epidermal growth factor，EGF) 可通過使ERK及AKT磷酸化的途徑刺激人骨髓 MSCs增殖，F(xiàn)arre等[11]報道成纖維細胞生長因子-4 (Fibroblast growth factor-4，F(xiàn)GF-4) 可使 MSCs的復(fù)制周期顯著縮短且不改變其多向分化潛能。最近，Zscharnack等[12]還發(fā)現(xiàn)氧濃度也可影響 MSCs的擴增，他們通過比較 5%和20%的氧氣濃度下MSCs的擴增，發(fā)現(xiàn)5%的氧濃度下MSCs形成的CFU-F比20%的氧氣濃度多2倍，并且老化程度也比20%的氧氣濃度輕。

以上研究表明，目前已能從技術(shù)上實現(xiàn)間充質(zhì)干細胞的體外擴增，但在大規(guī)模、系統(tǒng)地應(yīng)用于臨床治療前，急需解決的問題就是 MSCs擴增后的功能有效性與移植安全性，即在體外大規(guī)模擴增后，MSCs是否具有與原始干細胞相同的自我更新和多向分化潛能、表達相同的標記蛋白，以及是否具有致瘤性和移植帶來的不良反應(yīng)，這是衡量與決定擴增MSCs移植能否應(yīng)用到臨床治療的一個重要指標。因此必須在移植之前，對擴增后的MSCs進行“身份”鑒定和安全檢查。

2 擴增MSCs的有效性評價

擴增MSCs的有效性評價主要基于以下幾個方面：細胞的生物學特征如細胞形態(tài)；特異性細胞抗原表達；細胞因子表達譜；細胞增殖能力；細胞在一定條件下的分化能力等，即這些擴增MSCs必須處在未分化的可以維持自我更新的狀態(tài)。

如前所述，一般認為MSCs表達CD29、CD44、CD71、CD90、CD106、CD105、SB-10、SH-3、SH-4等表面抗原，不表達造血干細胞的表面標志如CD34，單核細胞/巨噬細胞表面標志CD14，抗原呈遞細胞即成纖維細胞表面標志HLA-DR等。Bruder等[13]在 1997年就已證明在沒有任何分化誘導(dǎo)物存在的條件下，25代前的MSCs形態(tài)、生長特點及表型特點等無顯著性差異，即MSCs的連續(xù)傳代不會改變其基本性狀。前面闡述的包括本課題組在內(nèi)的有關(guān)大規(guī)模擴增MSCs的研究中，也檢測了擴增后的MSCs的表型特征，均明確提出了擴增后的MSCs可以保持其表型不變，細胞形態(tài)也與普通條件下培養(yǎng)的MSCs相同。

MSCs具有多向分化潛能，可分化為多種中胚層組織細胞，如成骨細胞、成軟骨細胞、成肌細胞、成脂細胞等，還可誘導(dǎo)分化為非中胚層的細胞如神經(jīng)細胞和肝細胞[14-16]等。成骨和成脂分化能力也是目前公認的鑒別 MSCs的方法之一。許多學者在進行MSCs擴增研究時檢測了擴增后的MSCs是否具有多向分化潛能。如本課題組[6]及前面提到的Chen等[4]的研究中，均發(fā)現(xiàn)大規(guī)模擴增后的 MSCs可分化為成骨細胞、成軟骨細胞、成脂肪細胞等，能夠維持其多向分化潛能。Zhang等[17]研制的二軸生物反應(yīng)器結(jié)合聚已酸內(nèi)酯-三鈣磷酸 (Polycaprolactonetricalcium phosphate，PCL-TCP) 材料培養(yǎng)人胎兒來源的MSCs。相比于對照組，細胞可在短時間內(nèi)形成克隆，其成骨分化能力也好于對照組。他們將反應(yīng)器擴增出的 MSCs移植入小鼠體內(nèi)，也可有效地分化為成骨細胞。這些研究提示擴增的MSCs具有與原始MSCs相同的特性，具備臨床應(yīng)用的功能有效性，具有作為臨床移植種子干細胞的可能性。

MSCs有廣泛的細胞因子表達譜，在體內(nèi)可通過組織間隙作用于周圍細胞，發(fā)揮重要的旁分泌作用，除誘導(dǎo)、調(diào)控造血干細胞和基質(zhì)細胞的發(fā)育外，還廣泛參與免疫調(diào)節(jié)、細胞增殖、凋亡、內(nèi)源性前體細胞再生、血管再生等病理生理作用。目前發(fā)現(xiàn)MSCs可分泌包括造血因子、非造血生長因子、白細胞介素、趨化因子以及多種生長因子、細胞因子受體、細胞黏附作用受體[18-19]，表明 MSCs的功能可能是通過自分泌和旁分泌發(fā)揮的。特別是近幾年發(fā)現(xiàn)MSCs具有免疫抑制作用，許多學者都認為MSCs的旁分泌是其中重要機制之一。因此MSCs的分泌作用也是判定MSCs功能有效性的標準之一。但是，追溯了近十年的文獻，我們并未看到關(guān)于MSCs擴增后對其分泌作用的研究，說明目前對擴增后MSCs有效性的評價尚不完善，以后的研究應(yīng)重視擴增后MSCs分泌作用的研究。

3 擴增MSCs的安全性評價

同其他植入技術(shù)一樣，MSCs無論擴增與否，其應(yīng)用于臨床移植所面臨的最大質(zhì)疑就是安全性評價。MSCs由于其自身特點，安全性中主要涉及的問題就是致瘤性與免疫排斥。

3.1 致瘤性研究

2002年 Science雜志報道[20]，將人類胚胎干細胞植入帕金森病模型小鼠大腦內(nèi)，發(fā)現(xiàn)ESCs可分化為多巴胺能神經(jīng)元，對患病小鼠具有治療作用，但一些小鼠卻因ESCs轉(zhuǎn)化的畸胎瘤而死亡。這一現(xiàn)象對ESCs是否適合于臨床移植提出了質(zhì)疑。同樣，體外大規(guī)模擴增的MSCs是否也能夠發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化而具有腫瘤細胞的特性？這是擴增 MSCs應(yīng)用于人體之前必須解決的問題。

曾有實驗室發(fā)現(xiàn)體外長期培養(yǎng)的MSCs偶爾會出現(xiàn)“瘋長”現(xiàn)象，2~3 d即可長滿傳代。Rubio等[21]在2005年首次報道了體外長時間培養(yǎng) (4~5個月) 脂肪來源的人 MSCs可自然發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。后續(xù)研究中又發(fā)現(xiàn)脂肪來源的人MSCs在惡性轉(zhuǎn)化后出現(xiàn)一些與腫瘤細胞相同的基因表達特征，如p53、CDK2、CDK4、CDK6等表達均高于正常的MSCs[22]。Li等[23]也發(fā)現(xiàn)連續(xù)培養(yǎng) 12個月的小鼠骨髓 MSCs可發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化，并且將 MSCs移植入老年小鼠18~24個月，小鼠體內(nèi)可見纖維肉瘤形成。

事實上，干細胞與腫瘤之間的關(guān)系一直是研究者廣泛關(guān)注的問題。在關(guān)于腫瘤起源的假說中即有腫瘤起源于干細胞的觀點，近幾年也提出了腫瘤干細胞這一說法。許多學者認為，干細胞在長期的自我更新過程中 (如傳代次數(shù)或擴增倍數(shù)過多時)增殖調(diào)控途徑中某些基因發(fā)生突變或表達異常，從而引起細胞過度增殖，導(dǎo)致癌變。例如，Serakinci等[24]利用人MSCs研究干細胞形成腫瘤的過程，將端粒酶 hTERT轉(zhuǎn)染至 MSCs中構(gòu)建細胞系hMSC-TERT20，當細胞群體倍增水平 (Population doubling level) 達到256時，細胞失去接觸抑制。將這些細胞注射入10只小鼠，均能在體內(nèi)形成腫瘤。通過檢測發(fā)現(xiàn)，hMSC-TERT20細胞系由于啟動子超甲基化，細胞周期相關(guān)基因DBCCR1表達缺失，從而發(fā)生癌變。

前面提到的 Zhang等[17]研制的二軸生物反應(yīng)器，他們在體內(nèi)實驗中發(fā)現(xiàn)擴增后的 MSCs移植入小鼠體內(nèi)后并未發(fā)現(xiàn)腫瘤。在更高級的靈長類動物也獲得令人欣慰的結(jié)果，Liu等[25]用流式細胞儀分離 Flk-1(+)CD31(-)CD34(-)的猴和人骨髓來源的MSCs，體外擴增6代之后移植入活體內(nèi)，宿主無任何異常。這些結(jié)果提示在擴增倍數(shù)適當?shù)那闆r下MSCs移植宿主可能不會致瘤。

但是，經(jīng)擴增后的MSCs在應(yīng)用于臨床治療之前對其致瘤性進行嚴格檢測和全面評估以確保人體移植的安全是十分必要的。目前檢測致瘤性的主要方法有：形態(tài)學觀察；細胞周期檢測；刀豆蛋白 A凝集試驗 (檢測細胞表面結(jié)構(gòu)改變)；軟瓊脂克隆形成實驗 (檢測錨定非依賴性生長，Anchorage independent growth)；細胞核型分析；動物體內(nèi)致瘤性；組織化學等，現(xiàn)有的擴增MSCs致瘤性評價也是基于以上檢測標準，為了充分保證擴增MSCs移植的安全性，有必要從腫瘤細胞的多種特性入手，建立更全面的致瘤性評價體系。

3.2 免疫抑制作用

造血干細胞是最早應(yīng)用于臨床移植的干細胞，已有過移植后出現(xiàn)不良反應(yīng)的報道，主要的并發(fā)癥之一是移植物抗宿主病 (Graft verous host disease，GVHD)。GVHD是指供體的免疫活性細胞對免疫功能低下的受體抗原產(chǎn)生排斥反應(yīng)的疾病，嚴重時會造成患者死亡。因而免疫排斥問題一直被認為是干細胞臨床治療的一大安全障礙，擴增MSCs能否應(yīng)用于臨床首先也需要評價其免疫排斥能力。目前已證實，MSCs不表達MHCII類分子、FasL、B7-1、B7-2、CD40等，低表達MHCII類分子，從理論上將可避免受體免疫系統(tǒng)的殺傷作用。2000年，Liechty等[26]在妊娠早期的胎羊免疫功能發(fā)育前后，分別將人MSCs植入胎羊體內(nèi)。在這樣一個異基因體系中，人MSCs可存活長達13個月之久，移植后的MSCs還可分化為軟骨細胞、脂肪細胞、肌細胞、心肌細胞等多種細胞。令人驚奇的是，在胎羊免疫功能發(fā)育后，人MSCs也能長期存活而無排斥反應(yīng)。他們因此預(yù)言了 MSCs在臨床移植、組織工程及細胞、基因治療方面的巨大潛能，這要歸功于MSCs的一項獨特優(yōu)點——低免疫原性[27]。

2003年Tse等[28]發(fā)現(xiàn)，當MSCs與同種外周血單核細胞或同種異體T淋巴細胞混合培養(yǎng)時，MSCs不會引起T細胞的增殖，也不能刺激外周血單核細胞釋放 γ-干擾素，而作為對照組的成纖維細胞則能夠刺激這一過程，這表明MSCs具有免疫抑制作用。Ye等[29]的研究還發(fā)現(xiàn)，大鼠骨髓MSCs與同種異體CD3+的T細胞共培養(yǎng)時，在T細胞增殖受抑制的同時，致炎細胞因子如腫瘤壞死因子-α (Tumor necrosis factor-α，TNF-α)的水平降低，抗炎癥因子如轉(zhuǎn)化生長因子-β (Transforming growth factor-β，TGF-β)、IL-10的水平增高。進一步研究表明，MSCs對T細胞的免疫抑制具有 2個特點：一是免疫效應(yīng)為劑量依賴性[28]，即MSCs的數(shù)量越多，抑制效果越強。二是這種免疫抑制效果是可逆的[30]，即在有刺激物如植物血凝素 (Phytohaemagglutinin) 存在時將MSCs移去，T細胞的增殖即可回復(fù)到無MSCs存在時的水平。除T細胞外，MSCs還能抑制B淋巴細胞、樹突狀細胞 (Dendritic cells，DCs) 及自然殺傷(Natural killer，NK) 細胞的增殖，并且均不會引起它們的凋亡[31-35]。

鑒于這一特性，目前許多臨床研究中甚至嘗試利用MSCs治療一些疾病如GVHD、I型糖尿病及類風濕性關(guān)節(jié)炎等自身免疫性疾病。Ringden等[36]給8位患有類固醇抗藥性的3-4級急性GVHD患者和1位廣泛性慢性 GVHD患者注入平均為 1×106個MSCs細胞/kg體重，結(jié)果顯示其中6位急性患者痊愈 (除1位患有巨型細胞病毒急性胃腸炎)。另外2位注射MSCs后無明顯效果，死亡。5位患者在移植后2個月至3年內(nèi)仍存活，存活率顯著高于同時期未經(jīng)MSCs治療的另外16位GVHD患者。Le Blanc等[37]于2001年10月至2007年1月跟蹤了55位急性GVHD的患者，細胞來自HLA相同同胞供體、單倍體相同的供體和第三方HLA不全相合供體。研究發(fā)現(xiàn)其中30位患者完全治愈，9位患者病情得到改善。在注射MSCs期間和注射之后無患者出現(xiàn)不良反應(yīng)，治愈程度與供體的 HLA匹配程度無關(guān)。I型糖尿病是T細胞介導(dǎo)自身免疫系統(tǒng)對胰臟的β細胞攻擊的一種疾病，通過體內(nèi)和體外實驗，他們發(fā)現(xiàn)MSCs可降低T細胞活性從而阻止其侵入到胰島而引發(fā)糖尿病，Vija等[38]還證實MSCs可抑制T細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)對新生胰島 β細胞的攻擊。類風濕性關(guān)節(jié)炎 (Rheumatoid arthritis，RA) 也是由自身免疫障礙導(dǎo)致免疫系統(tǒng)攻擊關(guān)節(jié)的慢性免疫性疾病，有研究發(fā)現(xiàn)[39-41]，在體外MSCs可抑制T細胞的增殖、免疫應(yīng)答及其產(chǎn)生的因子如 γ-干擾素和TNF-α，降低炎癥反應(yīng)并抑制來自RA患者滑膜細胞產(chǎn)生的基質(zhì)降解酶，因而是一種很有潛力的治療膠原誘導(dǎo)性 RA的新方法，并且在動物實驗中也取得了較好的效果。Gonzalez等[42]將人脂肪來源的MSCs注入到患有膠原誘導(dǎo)性 RA的小鼠中，成功緩解了病情，并且降低了發(fā)病率。

由此看來，間充質(zhì)干細胞的免疫抑制特性使其在臨床應(yīng)用上的安全性高于其他成體干細胞，許多學者認為MSCs將在預(yù)防GVHD、排斥反應(yīng)及細胞治療等領(lǐng)域能夠發(fā)揮有效作用。遺憾的是，目前仍缺乏關(guān)于擴增后的MSCs是否能夠完整保持免疫抑制及抗GVHD特性的研究。本課題組自行研制灌注式三維微生物反應(yīng)器，利用灌注細胞系統(tǒng)和三維細胞培養(yǎng)的雙重優(yōu)勢，通過連續(xù)動態(tài)灌注細胞培養(yǎng)使反應(yīng)器的環(huán)境更接近細胞在體內(nèi)的生長狀態(tài)，并實現(xiàn)了微環(huán)境的流動變化效應(yīng)。前期實驗發(fā)現(xiàn)，利用該反應(yīng)器培養(yǎng)MSCs，能夠逼真地模擬循環(huán)的體內(nèi)微環(huán)境，較好地支持MSCs的生長，實現(xiàn)高效、可重復(fù)MSCs體外擴增[43]。下一步我們計劃利用該微生物反應(yīng)器開展MSCs體外擴增，進而深入研究擴增后MSCs的致瘤性及抗GVHD特性。希冀不久的將來能夠?qū)U增后的MSCs免疫抑制作用有一個完整系統(tǒng)的評價，為擴增后的MSCs臨床應(yīng)用上的安全性論證提供依據(jù)。

4 展望

毋庸置疑，MSCs移植給嚴重危害人類生命、降低人類生活質(zhì)量疾病的治療帶來了無限希望，MSCs擴增技術(shù)的發(fā)展也為在體外獲取足量種子細胞提供了可能，但畢竟MSCs臨床應(yīng)用的研究尚屬起步階段，擴增 MSCs更是由于其在體外所經(jīng)歷的復(fù)雜培養(yǎng)過程及輔助試劑、藥物的參與等，在臨床應(yīng)用前還有諸多問題需要解決。必須在獲得穩(wěn)定擴增效果的基礎(chǔ)上構(gòu)建一個立體全面的擴增MSCs有效性、安全性的評價體系，保證MSCs臨床治療安全化、規(guī)范化，才能推動MSCs的臨床應(yīng)用進程。

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