陳順平 余英豪

近年來(lái),隨著對(duì)非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中分子生物學(xué)機(jī)理的深入研究,以表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)為治療靶標(biāo)的分子靶向治療在NSCLC的治療中日漸突出。因此,檢測(cè) EGFR基因不但可以有效指導(dǎo)分子靶向藥物的使用,而且可以為肺癌的治療措施的制定、以及肺癌預(yù)后的判定提供了重要的信息。本文擬采用熒光原位雜交(FISH)技術(shù)對(duì)我院非小細(xì)胞肺癌石蠟樣本進(jìn)行 EGFR基因進(jìn)行檢測(cè),并結(jié)合免疫組化法檢測(cè) EGFR蛋白表達(dá)的情況,比較 2種方法的差異,為臨床篩選 EGFR酪氨酸激酶抑制劑適用者及選擇最佳治療方案提供可靠的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

標(biāo)本來(lái)源:27例患者均為我院 2009年 6月 ～2009年 12月行肺癌手術(shù)切除的病例,其中男性 15例,女性 12例;年齡 43～79歲,中位年齡 61歲。所有標(biāo)本均經(jīng) 10%中性緩沖福爾馬林液固定,常規(guī)石蠟包埋。病理類型:肺泡癌 10例、肺腺癌 9例、混合癌 8例。27例同時(shí)進(jìn)行免疫組化及 FISH檢測(cè)。

1.2 主要試劑與儀器

酸性亞硫酸鈉(美國(guó) Simga產(chǎn)品),蛋白酶 K(美國(guó)羅氏產(chǎn)品),探針:GLPEGFR/CSP7探針由北京金菩嘉公司提供。人抗 EGFR單克隆抗體(即用型)購(gòu)于福州邁新生物公司,產(chǎn)品編號(hào) MAB0196。

Olympus BX51型熒光顯微鏡、Dake原位雜交儀、電熱恒溫水槽、隔水式恒溫培養(yǎng)箱。

1.3 方法

1.3.1 檢測(cè)方法 FISH檢測(cè):①將 3μm組織涂膠切片浸于二甲苯中脫蠟至水。②50℃下用 30%酸性亞硫酸鈉處理組織切片 30～40 min。③室溫下用 2×SSC×3min×2次漂洗。④在組織上滴上自己配制即用型蛋白酶 K,在 37℃預(yù)熱的孵育盒中消化 25～35 min。⑤室溫下用 2×SSC×3 min×2次漂洗,乙醇梯度脫水固定,自然干燥。⑥避光環(huán)境中,玻片和探針混合液(7μl雜交緩沖液、1μl去離子水和 2μl探針),探針混合液滴于雜交區(qū)域,在溫度 83℃的自動(dòng)雜交儀中變性 6 min后置 37℃過(guò)夜雜交。⑦洗滌:第 2日移去蓋玻片,在溫度 46℃,玻片置于 2×SSC×10 min×2次,2×SSC/0.1%NP-40溶液中 5 min。玻片干燥后加 DAPI復(fù)染液,放于暗盒中復(fù)染數(shù)分鐘后用 OLYMPUSBX51熒光顯微鏡在 DAPI/FIFC/RHOD三色濾光鏡激發(fā)下觀察間期細(xì)胞熒光雜交信號(hào)。

IHC檢測(cè):采用 EnVision二步法,EGFR一抗工作濃度為 1∶150,嚴(yán)格按照說(shuō)明書操作。

1.3.2 結(jié)果判定 (1)FISH結(jié)果判定:紅色信號(hào)代表檢測(cè)的靶基因,綠色信號(hào)代表靶基因所在的染色體著絲粒。檢測(cè) EGFR基因計(jì)數(shù) 100個(gè)細(xì)胞,統(tǒng)計(jì) Ratio值(100個(gè)細(xì)胞核中紅色信號(hào)數(shù)/100個(gè)細(xì)胞核中綠色信號(hào)數(shù))。FISH陽(yáng)性分為:EGFR基因擴(kuò)增:①Ratio≥2為陽(yáng)性結(jié)果;②≥15個(gè)紅色信號(hào)的細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)的 10%以上;③出現(xiàn)成團(tuán)紅色信號(hào)的細(xì)胞;高多體性:Ratio＜2,但≥4個(gè)紅色信號(hào)的細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)的40%以上。FISH陰性:Ratio＜2為無(wú)擴(kuò)增。(2)IHC結(jié)果判定:染色結(jié)果根據(jù)細(xì)胞膜著色的陽(yáng)性細(xì)胞百分率和陽(yáng)性染色程度評(píng)價(jià)。著色細(xì)胞占計(jì)數(shù)細(xì)胞百分率≤5%為 0分;6～25%陽(yáng)性細(xì)胞為 1分;26～50%陽(yáng)性細(xì)胞為 2分;＞50%陽(yáng)性細(xì)胞為 3分。再結(jié)合染色強(qiáng)度,無(wú)色為 0分,淺黃色 1分,棕黃色 2分,棕褐色 3分。將每張切片著色細(xì)胞百分率得分與著色程度得分相乘,為其最后得分。同一視野如有染色強(qiáng)度不一,取其平均值作最后得分。0～1分為陰性(-),2～3分為弱陽(yáng)性(+),4～6分為中等陽(yáng)性(2+),6分以上為強(qiáng)陽(yáng)性(3+)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用 SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行描述性分析。

2 結(jié)果

27例 NSCLC標(biāo)本中,IHC法檢測(cè) EGFR表達(dá)(3+)的 14例,有 9例 FISH顯示陽(yáng)性 (64.29%),這 9例中有 5例為 EGFR基因高多體性擴(kuò)增(55.56%),4例為 EGFR基因擴(kuò)增(44.44%);IHC為(2+)的 6例標(biāo)本中,僅有 1例為高多體性擴(kuò)增(16.67%);IHC為(1+)的 2例以及 5例 IHC(-)的標(biāo)本均無(wú) EGFR基因擴(kuò)增。在 10例擴(kuò)增的標(biāo)本中,高多體性擴(kuò)增(6例)超過(guò)一半。

3 討論

EGFR屬于表皮生長(zhǎng)因子家族成員[1],又稱HER1,EGFR基因位于人類 7號(hào)染色體的短臂,由 118 kb組成,包括 28個(gè)外顯子。EGFR在多種上皮性腫瘤中呈高表達(dá),其過(guò)表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的增殖、活動(dòng)性、粘連性、侵襲性、凋亡抑制和血管生成相關(guān),能導(dǎo)致其下游信號(hào)傳遞過(guò)程異常激活,使細(xì)胞的轉(zhuǎn)化、增殖加快,抵抗細(xì)胞凋亡、細(xì)胞生存期延長(zhǎng),與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后以及治療反應(yīng)等相關(guān)[2]。EGFR在上皮性腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用,配體通過(guò) EGFR信號(hào)通路來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、存活和血管生成,由于 EGFR酪氨酸激酶是信號(hào)傳導(dǎo)的必要條件,因而成為腫瘤治療的重要靶分子。通過(guò)選擇性的酶抑制劑或單克隆抗體競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合細(xì)胞外配體結(jié)合位點(diǎn)可以阻斷酪氨酸激酶活化,從而抑制 EGFR的激活,阻礙腫瘤的發(fā)生發(fā)展。以 EGFR為靶標(biāo)的分子靶向藥物如 EGFR酪氨酸激酶抑制劑 Iressa(Genfitinib)已被美國(guó)食品藥品管理局(FDA)批準(zhǔn)用于治療晚期 NSCLC,治療 EGER基因擴(kuò)增 NSCLC患者中,有效率為 35%,疾病控制率高達(dá)70%[3]。同時(shí),多數(shù)臨床 III期試驗(yàn)表明,EGFR高拷貝數(shù)患者使用酪氨酸激酶抑制劑后生存顯著高于 EGFR低拷貝數(shù)患者,因此,EGFR拷貝數(shù)被認(rèn)為可能適合作為用藥后生存期判斷的指標(biāo)[4,5]。

IHC是目前臨床上常用的檢測(cè) EGFR蛋白表達(dá)的方法。該方法簡(jiǎn)便、價(jià)廉、可重復(fù)性好、對(duì)材料的要求不高,在臨床上廣泛應(yīng)用,是國(guó)內(nèi)檢測(cè) EGFR蛋白表達(dá)的主要方法。但是,IHC方法在標(biāo)本固定和處理中可能會(huì)使蛋白質(zhì)變性破壞而影響檢測(cè)結(jié)果,易造成假陰性或假陽(yáng)性,且結(jié)果判斷人為主觀性較強(qiáng) 。FISH是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的分子生物學(xué)技術(shù),已被廣泛用于臨床醫(yī)學(xué)檢測(cè),且 FISH技術(shù)敏感性和特異性高、簡(jiǎn)便快速、客觀性強(qiáng),實(shí)驗(yàn)過(guò)程中受到的影響較小,檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確,也可以定量判讀結(jié)果,但費(fèi)用相對(duì)較昂貴。

本實(shí)驗(yàn)中,我們對(duì) 27例 NSCLC患者進(jìn)行 FISH檢測(cè) EGFR基因狀態(tài)并結(jié)合其免疫組化結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析發(fā)現(xiàn),當(dāng) IHC法為強(qiáng)陽(yáng)性(3+),FISH陽(yáng)性符合率僅為 64.29%,符合率較低,而對(duì)于(2+)的患者中,只有 1例為高多體性擴(kuò)增,符合率為 16.67%。因此,我們認(rèn)為,對(duì)于 IHC為陽(yáng)性(3+)和(2+)患者需再做FISH實(shí)驗(yàn)確定是否存在 EGFR基因擴(kuò)增。IHC法為(+)或者(-)的標(biāo)本,FISH法的結(jié)果均為無(wú)擴(kuò)增。同時(shí),在 10例擴(kuò)增的標(biāo)本中,有 6例為高多體性擴(kuò)增,占到擴(kuò)增例數(shù)的大多數(shù),說(shuō)明由 7號(hào)染色體引起的EGFR基因多體性擴(kuò)增較為常見(jiàn),其鏡下表現(xiàn)為癌細(xì)胞核中紅色信號(hào)點(diǎn)數(shù)較多,但還未成團(tuán),信號(hào)各個(gè)點(diǎn)數(shù)清晰易辨,伴隨著染色體著絲粒綠色信號(hào)點(diǎn)數(shù)的增加。同時(shí),我們?cè)谂凶x過(guò)程也發(fā)現(xiàn)除了多體性擴(kuò)增引起的紅色信號(hào)點(diǎn)數(shù)增加外,EGFR基因擴(kuò)增鏡下一般表現(xiàn)為紅色信號(hào)點(diǎn)成簇狀集聚。因此,我們認(rèn)為對(duì)于 IHC法初篩為陰性(-)或(+)的患者,基本上可排除 EGFR基因擴(kuò)增;而對(duì)于 IHC法初篩為(3+)和(2+)的患者,2種方法的符合率相對(duì)較低,特別是(2+)的患者,在應(yīng)用靶向藥物治療前均應(yīng)進(jìn)行 FISH檢測(cè)以確定 EGFR基因的狀態(tài)。

綜上所述,應(yīng)用 FISH技術(shù)對(duì) EGFR基因擴(kuò)增檢測(cè)可以對(duì) IHC的補(bǔ)充,也避免 IHC假陽(yáng)性對(duì) NSCLC患者應(yīng)用酪氨酸激酶抑制劑治療效果的誤判,增加患者的負(fù)擔(dān)。同時(shí),FISH是1種快速,簡(jiǎn)便,結(jié)果可靠的基因檢測(cè)方法,易在臨床得到認(rèn)可。IHC的經(jīng)濟(jì)性可用于排除 NSCLC患者中 EGFR基因的擴(kuò)增,FISH可用于確診,這 2種方法相互補(bǔ)充將對(duì)于臨床應(yīng)用酪氨酸激酶抑制劑具有指導(dǎo)作用。

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