汪美鳳 平 鍵 綜述 成 揚 審校

肝纖維化是由于急性或慢性肝臟損傷導致的細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）在肝組織間質(zhì)中過度沉積所導致的一種可逆性病理改變，是慢性肝病向肝硬化進展的共同環(huán)節(jié)。在肝纖維化發(fā)生發(fā)展過程中，肝實質(zhì)細胞的損傷是肝星狀細胞（hepatic stellate cell，HSC）激活的始動環(huán)節(jié)，已證實HSC是ECM的主要來源，HSC激活并轉(zhuǎn)化為肌成纖維樣細胞，是肝纖維化發(fā)生發(fā)展的核心環(huán)節(jié)，許多因素參與了該過程的調(diào)控，其作用機制復雜，本文就HSC活化時主要信號通路的作用機制簡述如下。

一、轉(zhuǎn)化生長因子 -β1（TGF-β1）/Smad 途徑

轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transforming growth factor，TGF-β1）是細胞因子TGF-β超家族成員之一，因其能促進成纖維細胞的轉(zhuǎn)化生長而得名。其主要生物學作用有：抑制大多數(shù)細胞的增殖，誘導細胞分化，免疫抑制，促進ECM合成，調(diào)節(jié)膠原生成和組織修復，與器官纖維化發(fā)生發(fā)展有著密切的關(guān)系。在肝纖維化中TGF-β1主要是促進HSC合成ECM，促使HSC分泌金屬蛋白酶組織抑制物，下調(diào)降解蛋白酶的合成，阻止新合成的細胞基質(zhì)的分解而減少ECM的降解，從而打破ECM合成與降解的平衡，使ECM沉積增多，加速肝纖維化的發(fā)展。此外，TGF-β1還可上調(diào)由Sp1和Smad2反式作用因子介導的人類I型膠原，促進纖維化的發(fā)展[1]。Smad蛋白是已知的唯一的I型受體胞內(nèi)底物，是TGF-β家族信號從受體到細胞核的胞內(nèi)轉(zhuǎn)導分子。TGF-β1在體內(nèi)的表達主要與TGF-β/smad信號通路有關(guān)，TGF-β1活化后與細胞膜表面受體結(jié)合，激活Smads蛋白形成復合物，轉(zhuǎn)入核內(nèi)，與各種轉(zhuǎn)錄因子相結(jié)合，從而調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄。Smads蛋白介導了TGF-β1的胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導?，F(xiàn)已知至少有9種Smad蛋白，共分為三類，第一類為：受體型Smads（R-Smads），主要有Smad1、2、3、5、8，其中 Smad2 和 Smad3 介導 TGF-β 和活動素的信號，Smad1、5、8 則轉(zhuǎn)導骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）信號。Smad1、5、8 及 BMP-7 相互作用，可抑制肝纖維化的形成[2]；第二類為通用型Smads co-Smads）是TGF-β必要的信號中轉(zhuǎn)分子，有Smad4；第三類為抑制性Smads（I-Smads），抑制其他二類 Smads，主要有 Smad6、Smad7，Smad6抑制BMP信號轉(zhuǎn)導，而Smad7則是抑制TGF-β與BMP信號轉(zhuǎn)導，因此可抑制肝纖維化的形成。

TGF-β1在體內(nèi)均以無活性的形式存在，被激活后可啟動信號的傳導，激活Smad2和Smad3羧基端4個氨基酸的保守序列（SSXS），使Smad2和Smad3與Smad4形成異源寡聚物，將TGF-β1信號從胞漿向胞核轉(zhuǎn)位聚集，調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄活化。Smad7是TGF-β1信號轉(zhuǎn)導抑制分子，可與Smad2或Smad3競爭結(jié)合TGF-β1型受體或Smad4，阻斷Smad2或Smad3被磷酸化并轉(zhuǎn)位至細胞核內(nèi)，抑制信號的轉(zhuǎn)導。當Smad7表達被抑制或R-Smads過度表達，可致TGF-β持續(xù)激活，引起肝纖維化，因而可以通過上調(diào)Smad7的表達來治療肝纖維化。Liu等[3]研究表明用黃芪丹參提取混合物可明顯抑制由TGF-β1引起的細胞損害，明顯減少Smad2C-末端和Smad3連接區(qū)域的磷酸化，用黃芪丹參提取混合物療法可下調(diào)Smad2/3/4混合物水平，但卻可上調(diào)劑量依賴性Smad7的表達。Wu[4]等研究表明氧化苦參堿能有效降低實驗性大鼠肝臟組織中膠原蛋白的產(chǎn)生和沉積，促進CCl4誘導的肝纖維化SD大鼠Smad7的表達，抑制Smad3和CREB結(jié)合蛋白（CREB-binding protein，CBP）的表達并且可調(diào)節(jié)TGF-β/Smad信號通路。Liang等[5]研究發(fā)現(xiàn)熊去氧膽酸也可通過抑制TGFβ1、Smad3和CBP的表達，增加Smad7的表達來作用于TGF-β/Smad通路從而發(fā)揮其抑制肝纖維化的作用。TGF-β/Smad通路中各型Smad分子之間精密合作，共同完成生理及病理狀態(tài)下TGF-β的生物學效應，通過對其機制的深入研究，有希望為肝纖維化的治療找到清晰的思路和更加有效的有針對性的治療方法。

二、MAPK通路

細胞絲裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activatedp rotein kinase，MAPK）通路是又一個重要的細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導通路。MAPK蛋白家族包括細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（Extracellular regulated kinase，ERK）、ERK5、c-jun 氨基末端激酶（c-jun N-terminal kinase，JNK）和p38等4個MAPK亞族。這些MAPK亞族能被各種炎性刺激所激活，并對炎癥的發(fā)生發(fā)展起重要作用，且活化的MAPK將信號轉(zhuǎn)導入核內(nèi)，能使多種轉(zhuǎn)錄因子磷酸化，隨后發(fā)生一系列的細胞反應，如細胞的增殖與轉(zhuǎn)化。

（一）ERK途徑 ERK是HSC增殖的正性調(diào)節(jié)蛋白之一。ERK在細胞核內(nèi)與主要的核靶轉(zhuǎn)錄因子ELK-1結(jié)合，調(diào)節(jié)細胞生長和分化。而血小板源性生長因子（platelet-derived growth factor，PDGF）誘導的ERK細胞內(nèi)信號途徑是HSC活化和增殖的主要方式，Ras結(jié)合PDGF受體后激活Raf-1、MAPK kinase-1/2和 ERK-1、2?；罨?ERK轉(zhuǎn)導入核內(nèi)[6]，磷酸化轉(zhuǎn)錄因子Elk2-1和SAP，產(chǎn)生細胞增殖反應，這一過程可能是通過調(diào)節(jié)細胞周期蛋白D1和細胞周期蛋白依賴性激酶（cyclin dependent kinase，CDK）來實現(xiàn)。在對大鼠肝纖維化基因表達結(jié)構(gòu)及關(guān)鍵基因的研究中發(fā)現(xiàn)[7]RSK和ERK都是MAPK通路的關(guān)鍵基因，與肝纖維化時I型膠原的表達緊密相關(guān)，siERK1顯著抑制HSC的增殖，常伴隨著誘導HSC的凋亡和I型膠原的減少，選擇針對HSC的ERK1抑制劑作為靶向，將為肝纖維化的治療提供新的策略。本課題組研究發(fā)現(xiàn)[8]丹參酚酸B通過抑制ERK信號轉(zhuǎn)導，抑制HSC的激活與增殖和抑制HSC內(nèi)I型膠原的產(chǎn)生來抑制肝纖維化的發(fā)生發(fā)展，其作用機制與其抑制ERK的磷酸化有關(guān)。

（二）JNK途徑 JNK也是HSC細胞增殖的一個正性調(diào)節(jié)蛋白，多種應激刺激如細胞因子、細胞毒性藥物、活性氧等都能增加HSC中JNK的活性。在靜息或激活的HSC中，阻斷JNK的活性可阻止HSC增殖。在大鼠肝門纖維母細胞的培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)[9]肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）能抵抗Erk1/2的磷酸化和血小板衍生生長因子誘導的促有絲分裂刺激，并誘導JNK1磷酸化促進凋亡細胞死亡。Kluwe等[10]對來自膽管結(jié)扎或服用CCl4的大鼠及慢性乙肝、非酒精性脂肪性肝炎病人的纖維化肝臟進行檢測，測定JNK的磷酸化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在上述原因所致的纖維化肝臟中JNK的磷酸化水平急劇升高，并且主要存在于肌成纖維樣細胞中。在體內(nèi)，JNK 1缺乏大鼠在膽管結(jié)扎或CCl4處理后，纖維化水平降低，而JNK 2缺乏大鼠膽管結(jié)扎后纖維化水平升高，而CCl4處理后纖維化水平不變。這表明JNK各亞型及不同的造模方法對肝纖維化所起的作用不同。

（三）p38途徑 與JNK和ERK對HSC的增殖作用不同，維持JNK的靜止狀態(tài)，能阻止HSC增殖，而阻斷p38卻能促進HSC增殖，這表明p38對HSC的增殖起著負性調(diào)節(jié)作用，可調(diào)節(jié)HSC產(chǎn)生膠原。Schindler等[11]研究顯示炎癥刺激可激活P38MAPK，而P38 MAPK也可以影響生物體內(nèi)致炎與抗炎因素的平衡，決定炎癥的進程.除此之外P38 MAPK也在細胞應激、凋亡、細胞周期和生長等多種生理和病理過程中起重要作用[12]。Wu等[13]研究表明CPU-II2（一種新型齊墩果酸衍生物）可通過p38 MAPK通路調(diào)節(jié)HSC的功能減弱肝纖維化的發(fā)展。p38的抑制劑可促進HSC增殖，提示p38的激活可抑制HSC增殖，阻斷p38MAPK能部分阻止TGF-β的促纖維化作用。

三、過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）途徑

過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome Proliferatoractivated receptor，PPAR）屬I型核激素受體超家族成員，是一類新的固醇類激素受體，可被脂肪酸及代謝產(chǎn)物激活，是調(diào)節(jié)脂肪細胞分化和能量代謝的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，分為PPARα、β、γ三型?，F(xiàn)在研究較多的是PPARγ信號途徑。PPARγ具有多種生物學效應，在脂質(zhì)代謝、糖代謝、抑制炎癥反應、細胞分化、抑制細胞增殖和誘導細胞凋亡等方面發(fā)揮重要作用。將PPARγ的特異激活劑加入到激活的HSC細胞培養(yǎng)液中，能抑制膠原的合成和拮抗PDGF誘導的HSC增殖、趨化和遷移，從而起到抗纖維化的作用。Bruck等發(fā)現(xiàn)[14]PPARγ與維甲酸受體聯(lián)合與單獨應用相比可顯著抑制硫代乙酰胺誘導的肝纖維化，其機制可能是聯(lián)合應用加強了對HSC增殖的抑制，減少促炎因子TGFβ1和TNF-α的分泌。本課題組[15～17]采用肝臟原位灌流酶消化、Nycodenz密度梯度離心法分離大鼠HSC，動態(tài)觀察HSC表型變化并檢測PPARγ表達水平。發(fā)現(xiàn)PPARγ表達水平隨著HSC活化程度的增加不斷下降。而激活PPARγ能抑制HSC增殖，抑制α-SMA、I型膠原和核RelA的表達，顯著升高MMP2和9的活性。并能夠誘導HSC凋亡，抑制抗凋亡因子Bcl-2的表達，促進促凋亡因子Bax表達。促進HSC中PPARγ的核轉(zhuǎn)位/重分布，顯著下調(diào)Cyclin D1基因、活化Rel A蛋白和I型TGFβ受體蛋白表達水平，升高MMP2和9的活性。因此PPARγ是維持HSC作為靜止狀態(tài)的表型上所必需的，PPARγ表達減少與HSC激活密切相關(guān)，而激活PPARγ通路可抑制HSC的活化，延緩肝纖維化形成，是逆轉(zhuǎn)肝纖維化的新途徑。

四、瘦素（leptin）受體介導的信號轉(zhuǎn)導途徑

瘦素是肥胖基因（obese，ob）的編碼產(chǎn)物，主要由白色脂肪組織產(chǎn)生并分泌，在其他組織中如胎盤、骨骼肌、活化的HSC等也有表達。體內(nèi)脂肪量、進食、胰島素、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）等都可影響瘦素的分泌。現(xiàn)已知瘦素具有廣泛的生物學效應，對一系列代謝過程產(chǎn)生影響，如胰島素的釋放、脂肪的合成和分解；它還參與免疫炎性反應、損傷修復、腫瘤生長等病理生理過程?；罨腍SC參與了瘦素的合成與分泌，而瘦素也可作用于活化的HSC，促進HSC增殖并抑制它的凋亡，并可以促進肝內(nèi)TGF-β1、PDGF等細胞因子的表達，增加I型前膠原的表達，減少ECM的降解，從而促進纖維化發(fā)展。瘦素主要表達于HSC，并可能通過竇內(nèi)皮細胞發(fā)揮重要的促纖維化作用，瘦素在肝纖維化進展中起重要作用，尤其在肝纖維化的中晚期。所以抑制瘦素表達，可抑制HSC的活化，從而減緩肝纖維化進程。Wang等[18]發(fā)現(xiàn)瘦素介導的HSC和肝纖維化是通過其對枯否細胞的間接作用實現(xiàn)的，而這個作用很大程度上由TGF-β1介導實現(xiàn)。Qamar等[19]研究發(fā)現(xiàn)瘦素在細胞凋亡中所起的作用受大鼠的種類和引起凋亡的原因影響。對于野生型大鼠，瘦素能產(chǎn)生更少的凋亡更多的α-SMA，并且瘦素可避免HSC體內(nèi)體外的的凋亡。瘦素的抗凋亡作用需要瘦素受體與線粒體激活作用鄰近的凋亡通路的相互作用。

五、整合素（integrin）信號轉(zhuǎn)導通路途徑

整合素是廣泛存在于動植物細胞表面的一種糖蛋白受體家族分子，是介導細胞與ECM間及細胞與細胞間的一類細胞黏附分子。它是由α、β兩種亞基組成的異源二聚體，含有18種α亞基和8種β亞基。根據(jù)β亞單位的不同整合素可分為8種類型，同一類型β亞單位相同，而α亞單位不同。整合素作為細胞膜上一類肯定的受體分子，其配體主要為ECM，還包括細胞間黏附分子、血管細胞黏附分子和血清游離蛋白分子等。整合素作為HSC細胞膜上的異二聚體跨膜蛋白，它不僅將ECM與細胞連結(jié)在一起，而且將信息由細胞外傳至細胞內(nèi)，介導信號的傳遞。

整合素在正常及病變肝組織種的分布均十分的廣泛，整合素在肝臟的表達方式與在其他組織細胞中不同，有些亞型在正常生理條件下并無表達，而在纖維化過程中則被誘導表達。此種作用主要由ECM受體-整合素所介導。在肝纖維化過程中各種整合素分子起著不同的作用，α1β1是膠原和LN雙重受體，對HSC收縮功能至關(guān)重要，且配體與受體的親和力受二價陽離子的調(diào)節(jié)；α2β1是一種膠原受體并可與L及FN反應；而α6β4可能與HSC收縮有關(guān)，也可以介導HSC與肝細胞相互作用。用免疫組化和RT-PCR法檢測[20]發(fā)現(xiàn)膽管閉塞小鼠體內(nèi)整合素αvβ6和ECM沉積水平上調(diào)，整合素αvβ6或ECM降解的抑制可能是未來治療策略中具有吸引力的靶點。在體內(nèi)[21]抑制整合素αvβ3可減少血管生成，加劇膽管結(jié)扎和硫代乙酰胺誘導的大鼠肝纖維化，盡管這種抗肝纖維化作用是在體外通過作用于HSC而實現(xiàn)的，但因其減少血管生成的同時加重了肝纖維化，所以這種血管生成抑制劑需慎用于肝纖維化病人。

六、NF-κB信號轉(zhuǎn)導通路

NF-κB是一種具有轉(zhuǎn)錄激活功能的蛋白質(zhì)，屬于NF-κB/Rel蛋白家族[16]。包括 p65、p50、p52、c-Rel和 RelB 5 種NF-κB/Rel蛋白，組成同源或異源二聚體，其中p65和p50組成的異源二聚體最多見。NF-κB是調(diào)節(jié)炎癥反應最為重要的轉(zhuǎn)錄因子，在受到氧自由基、TNF-α、IL-1、LPS及紫外線等刺激下NF-κB可被激活，并啟動TNF-α、IL-1、細胞粘附分子和環(huán)氧合酶-2等基因轉(zhuǎn)錄，導致TNF-α、IL-1等促炎因子大量產(chǎn)生，引發(fā)炎癥反應。這說明NF-κB的活化是抑制放射線、化療抑制TNF誘導細胞凋亡的重要因素之一，而維生素E可通過清除氧自由基，抑制NF-κB的活化。抑制NF-κB的活化可明顯增強細胞對放射線、化療和TNF等介導的凋亡誘導作用。NF-κB還可介導抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)兒茶酚氧位甲基轉(zhuǎn)移酶，而兒茶酚氧位甲基轉(zhuǎn)移酶參與炎癥疼痛反應，這說明NF-κB還可抑制疼痛。靜止HSC向活化HSC轉(zhuǎn)化時，NF-κB的結(jié)合活性增加，通過誘導纖維化因子，介導肝纖維化過程。已發(fā)現(xiàn)MIκBα的表達可以抑制NF-κB蛋白的表達，提高大鼠HSC對TNF-α的敏感性，通過誘導HSC的凋亡，從而抑制肝纖維化[22～23]。

七、小結(jié)

綜上所述，活化HSC增殖過程中所涉及的信號轉(zhuǎn)導極為復雜，這些信號通路相互聯(lián)系相互作用，形成了錯綜復雜的信號傳導網(wǎng)絡系統(tǒng)，共同介導慢性肝損傷至肝纖維化的漫長病理過程。要想以單一的方式來逆轉(zhuǎn)肝纖維化似乎有些困難，對于各通路中HSC的激活、產(chǎn)生、增殖機制，目前的研究還不夠理想，只有了解其機制，找到特異性的阻斷方法，才能有針對性的治療肝纖維化，得到滿意的療效。

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