劉心偉,朱文豪,李 何

(1.河南省體育科學研究所,河南鄭州 450044;2.河南省農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)研究所,河南鄭州 450002;3.信陽職業(yè)技術學院化學工程系,河南信陽 464000)

基因克隆技術研究進展

劉心偉1,朱文豪2,李 何3

(1.河南省體育科學研究所,河南鄭州 450044;2.河南省農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)研究所,河南鄭州 450002;3.信陽職業(yè)技術學院化學工程系,河南信陽 464000)

基因克隆;圖位克隆;轉座子標簽;表達序列標簽;差異表達基因

幾種模式生物基因組測序和人類基因組計劃(human genome project,HGP)的相繼完成,使人們對基因的研究很快進入后基因組時代。基因組學時代的主要任務是圖譜制作和序列測定,后基因組學時代則是進行基因組功能注釋(genome annotation),這也是功能基因組學的主要研究目標[1-2]。如何利用基因這一重要的資源,日益成為研究焦點。關于基因專利權的建立和完善的基因爭奪大戰(zhàn)的硝煙也正在彌漫全球?？寺』虿粌H可以用來興旺生命科學工業(yè) (制藥業(yè)等),改良農(nóng)作物、畜禽品種等,還可以對遺傳性疾病進行基因治療,探索疾病的分子機制和生物發(fā)育調控規(guī)律?？寺』虻耐緩接袃煞N,正向遺傳學和反向遺傳學途徑。前者是依據(jù)目標基因所表現(xiàn)的功能為基礎,通過鑒定其產(chǎn)物或某種表型突變而進行的;后者則著眼于基因本身,通過特定的序列或在基因組中的位置進行?；虻目寺∫话悴捎孟铝屑夹g:同源序列技術、差異表達基因分離技術、表達序列標簽技術、圖位克隆技術和轉座子標簽技術等。

1 功能性克隆

1.1 通過基因產(chǎn)物的克隆技術 在傳統(tǒng)遺傳學

(正向遺傳學)占主導地位的時代,人們以基因產(chǎn)物為導向來分離克隆基因 (功能克隆)。由于基因產(chǎn)物的結構、功能已知,可通過分析部分多肽或末端氨基酸序列,反推其核苷酸序列,設計探針或引物從基因組DNA文庫或 cDNA文庫中篩選克隆,也可以制備產(chǎn)物抗體,從表達載體構建的 cDNA文庫中篩選相應克隆,進而分離目的基因。

若研究者可得到足夠多的純化目的蛋白以用于制備特異性抗體時,可以采用經(jīng)典的免疫篩選表達文庫的方法,篩選陽性克隆獲取其目的基因[3],除了免疫篩選方法外,也可根據(jù)目的蛋白的生物學功能,利用同位素標記的配體來篩選受體表達的陽性克隆。當所分離的目的蛋白較難大量獲得,但純度較高時,可利用其中的一段氨基酸序列,反推出其基因序列,據(jù)此合成寡核苷酸用于 cDNA文庫的篩選;或根據(jù)所獲得的基因序列,指導 5’端的引物合成,根據(jù) mRNA 3’端 poly-A序列指導合成 poly-T的 3’端引物,用 PCR技術從制備細胞的 mRNA或直接從胞漿內(nèi)溶物物中合成相應的 cDNA,將該cDNA克隆到表達載體上進行產(chǎn)物表。

1.2 同源性序列克隆技術 隨著基因研究的不斷深入,人們發(fā)現(xiàn)幾乎所有的基因與其他的基因都有一定的聯(lián)系:生物的種、屬之間編碼基因序列的同源性高于非編碼區(qū)的序列?；诖嗽?在其他種屬同源基因被克隆的前提下,構建 cDNA文庫或基因組文庫,然后用已知分子高保守序列設計簡并引物,并用簡并引物對含有目的基因的 DNA文庫進行 PCR擴增,再對 PCR擴增產(chǎn)物進行擴增、克隆和功能鑒定。

對于同源性很高的基因,可以直接用作探針進行非嚴謹性雜交篩選另一物種的 DNA文庫。如Funkenstein等用紅海鯛和紅鱒魚的生長激素 (GH)基因的 cDNA篩選 gsb的 cDNA文庫,得到 gsb GH的 cDNA克隆[4]。Almuly等用 gsb GH的 cDNA篩選 gsb的基因組文庫,進一步克隆了 gsb GH基因[5]。

同源性序列克隆技術自提出以來,受到了國內(nèi)外學者的廣泛重視,發(fā)展很迅速,但有些問題是值得重視和思考的:①由于密碼子的簡并性和不同同源序列間同源程度的差異,簡并引物的特異性要設計得當,必要時需要設計幾套引物組合。②由于某些同源序列并不專屬于某一基因家族,因而擴增產(chǎn)物不一定是某一基因家族成員。③基因家族成員往往成簇存在,克隆的基因片段是否為目的基因尚需進一步判斷。因此對 PCR擴增產(chǎn)物和克隆產(chǎn)物,有必要進行基因與性狀共分離分析,插入失活或遺傳轉化等功能鑒定工作,以便最終篩選到目的基因。

2 表型克隆技術

細胞在增殖、分化、外界環(huán)境變化等某些異常狀態(tài)下 (如癌變、異常增生),常有某些新基因特異性表達或表達異常地增高,而另一些基因可能表達降低或缺失,因而分離差異表達基因將是認識生物體的生長發(fā)育等生命活動過程的入手點,以此為基礎,才能深入理解基因的結構、功能、表達與調控。差異表達基因的分離方法也伴隨分子生物學技術的發(fā)展由單一化發(fā)展為多元化,而且呈各種方法互相結合的趨勢。

分離差異表達基因的 3種基本方法為:差式篩選 (differential screening)[6]、扣除雜交 (subt ractionhybridization)[7-9]、差異展示反轉錄 PCR(differential display reverse t ranscription PCR,DDRTPCR[10])。差式篩選法是分別從有特異表達基因的目標樣 (target sample,TS)和無特異表達基因的參照樣 (reference sample)中提取 mRNA,反轉錄為cDNA,并構建 TS的 cDNA文庫,分別將從 TS和 RS中提取 mRNA制成 cDNA探針,分別用 TS和 RS的cDNA探針與 TScDNA文庫的菌落或噬菌斑作原位雜交,選出只與 TS雜交,而不與 RS雜交的克隆即為 TS特異表達的克隆。此法常要經(jīng)過多輪菌斑雜交,不僅費力費錢,重復性差,而且靈敏度很低?？鄢s交則是用 TS提取的 mRNA反轉錄成 cDNA探針與 RS的過量 mRNA或 cDNA雜交,經(jīng)兩輪充分雜交后,移去雜交分子和過量的 RS的mRNA或 cDNA,將不形成雜交體的 TS的 cDNA純化富集,擴增,建立相應 cDNA文庫即為差異表達基因 cDNA文庫。但此法回收 cDNA量有限,重復性差,靈敏度低。DDRT-PCR則是分別用 TS和 RS的總mRNA作模板,利用 12個可能的錨定引物 T11MN錨定mRNA的 olyA末端,借助逆轉錄酶合成 cDNA第一鏈,得 mRNA/cDNA,再用相同的 3’錨定引物和 5’端隨機引物分別擴增 TS、RS的 mRNA/cDNA,擴增產(chǎn)物用序列膠電泳分析差異表達情況,將差異帶DNA回收,可進一步鑒定分析,最終獲得差異表達基因。它與前二者相比,速度快,易操作,可以鑒定低豐度差異表達的 mRNA,分析 2種以上樣品基因的差異表達等優(yōu)點,但仍存在假陽性率高、重復性差、擴增片段短等問題。下面就這些方法的具體過程作詳細介紹。

2.1 代表性差示分析法 (RDA) 該法可用于分離與生理條件改變相關的基因及不同發(fā)育階段差異表達的基因,具體過程個如下:①制備擴增子。提取TS和 RS的 mRNA并反轉錄制備雙鏈 cDNA即 tester cDNA和 driver cDNA。然后用限制性內(nèi)切酶切,將酶切片段裝上接頭,末端補平后,加入接頭引物進行 PCR擴增。②扣除雜交。去除接頭后僅對 tester片段加上新的接頭,用過量的 driver cDNA與之雜交退火,將形成三種產(chǎn)物:tester/tester、tester/driver、driver/driver。③特異性片段的擴增。末端補平后,加入新接頭引物進行 PCR。3種產(chǎn)物中僅自身退火形成的 tester/tester兩端均能和新引物配對而呈指數(shù)擴增,tester/driver僅一端可和新引物配對而呈線性擴增,Driver/driver無引物配對不擴增。然后用綠豆核酸酶去除單鏈 DNA分子,再進行 PCR富集特異表達 cDNA片段。④對特異片段進行克隆,通過 FISH等技術進一步分離特異表達基因。

2.2 抑制性差減雜交 PCR法 (SSH) SSH的基本流程如下:①第1次雜交。提取 TS和 RS的 mRNA反轉錄為 tester cDNA和 driver cDNA,用 Rsa I或HaeⅢ酶切成平頭末端 cDNA,分成均等 2份,分別加不同的接頭,再分別與過量的 driver cDNA雜交,將形成 4種產(chǎn)物:a,單鏈 tester cDNA、b,自身退火的tester/tester雙鏈、c,異源退火 tester/driver雙鏈、d,drivercDNA。②第2次雜交。合并 2份雜交產(chǎn)物,加入新的變性 driver cDNA退火、雜交,這次除了 a、b、c、d 4種產(chǎn)物外還形成產(chǎn)物 e,e是 tester自身退火形成,但兩端帶不同接頭。③特異性片段的擴增。末端補平后,先后加接頭的內(nèi)、外側引物擴增,a和 d無擴增,b由于兩端接頭互補形成發(fā)夾結構也無擴增,c僅一端有引物結合呈線性擴增,僅 e兩端可配不同引物而呈指數(shù)擴增。④特異性片段 e克隆,并進一步分離差異表達基因。

該法通過 2次雜交和 2次 PCR,使假陽性率可降到 6%[11],且靈敏度高。用 SSH可一次同時分離幾十至幾百個差異基因,效率大增。

2.3 交互差減差異 RNA顯示 (RSDD) RSDD的主要過程如下:①交互差減。分別提取具有差異表達的 2種組織細胞 A、B的 mRNA,反轉錄為 cDNA,并構建 cDNA文庫。將這 2個文庫進行交互差減得到 A減B和 B減 A的 2個差減 cDNA文庫,由于構建文庫所用的噬菌體載體上帶有質粒載體的結構,載體進入宿主后,其上質粒載體被切下,得質粒cDNA文庫。②差異顯示。用 3’錨定引物和 5’隨機引物對 2個差減文庫提取的 DNA分別進行 PCR擴增,將擴增產(chǎn)物用 5%序列膠電泳,顯示并分離差異條帶,回收差異 DNA,再次擴增后,獲得富集的差異表達片段。③表達分析。采用反向Northern分析和Northern分析鑒定經(jīng)再次擴增的差異 DNA片段的真?zhèn)巍７聪騈orthern分析是將差異顯示得到的擴增后 DNA片段轉膜,分別與來自 A、B細胞系的總mRNA經(jīng)反轉錄制備的 32 P標記的 cDNA第一條鏈探針進行雜交,只與親本來源細胞系雜交,而不與另一細胞系雜交的即為真正差異表達的基因。④對差異片段克隆、測序,并進一步分離獲得差異表達的基因。

RSSD可以有效快速地鑒定由于細胞生理變化而在基因組中差異表達的基因,它結合了 DDRTPCR和扣除雜交的優(yōu)點,減少或消除了共有序列,使序列膠上條帶清晰度增加,并使低豐度序列得到富集,降低了假陽性率,且 RSDD僅用較少的引物進行逆轉錄 PCR就可分析全部差異表達基因,但RSSD并不能完全杜絕假陽性。Kang等用 RSDD法克隆并證實了促進腫瘤發(fā)展的基因(PEGene)和抑制腫瘤發(fā)展的基因 (PS Gene)[12]。

3 圖位克隆技術

隨著各種生物分子標記連鎖圖的相繼建立和越來越多的基因被定位,在 90年代初圖位克隆技術也應運而生。其原理是根據(jù)功能基因在基因組中存在相對較穩(wěn)定的基因座,在利用分子標記技術對目的基因進行精確定位的基礎上,用與目的基因緊密連鎖的分子標記篩選 DAN文庫 (如 YAC、BAC或 Cosmid文庫),構建出目的基因區(qū)域的物理圖譜,再通過染色體步行 (chromosome walking)逐步逼近候選區(qū)域或通過染色體登陸 (chromosome landing)的方法最終找到包含該目的基因的克隆進而克隆該基因。

定位克隆理論上適用于一切基因,但也存在應用上的一些不足:如果要構建完整的基因組文庫,建立飽和的分子標記連鎖圖和完善的遺傳轉化體系,對基因組較大、標記數(shù)量不多而重復序列較多的生物采用此法投資大且效率低,因而圖位克隆技術目前僅局限于擬南芥、水稻、番茄等圖譜飽和的模式植物上。

4 表達序列標簽技術 (EST)

EST是完整基因上能特異性標記基因的一部分序列,通常包含了基因足夠的結構信息區(qū),從而與其他基因相區(qū)分,大規(guī)模 EST克隆和資料庫的建立,為利用生物信息學克隆基因提供了條件。其基本原理是從組織特異性或細胞特異性的 DNA文庫中隨機挑選克隆,并進行 5’和 3’端部分測序,通過對基因庫的檢索,可以檢測所測序以及翻譯的多肽氨基酸序列與基因庫中已知的是否有同源性,最后對發(fā)現(xiàn)的新基因進行突變檢測和表達分析?；具^程如下:①對已知的部分序列進行數(shù)據(jù)庫分析,篩選出代表新基因的 EST及相應的重疊群,定位信息等,根據(jù)所得信息設計引物,制備探針。②用探針進行cDNA文庫篩選,得 cDNA陽性克隆,接著用設計引物與所得 cDNA陽性克隆載體臂進行巢式 PCR和5’、3’-RACE,得 5’端和 3’端部分序列 (約 400 bp)。③對所得陽性克隆和末端序列進行測序。④通過數(shù)據(jù)庫對新序列進行分析,包括與已知基因的同源性分析、拼接延伸、ORF識別、結構分析、翻譯蛋白質分析等。⑤若第一步有新 EST的定位信息,即可對基因進行定位和結構分析;若無定位信息,還要篩選基因組文庫,進行測序和 FISH定位等工作。⑥最后對發(fā)現(xiàn)的新基因進行突變檢測和表達分析。

該技術建立在大量已有的生物信息資源基礎上的,同時,結合了目前的新技術,為大規(guī)?？寺』蛱峁┝私輳?。它不僅可檢測到許多已知的基因,更可以發(fā)現(xiàn)許多未知的基因。

EST還具有廣泛的用途。利用對獨立 EST的拼接可獲得新基因的全長 cDNA序列;利用 EST標簽克隆的斑點雜交可鑒定涉及組織或器官發(fā)育過程不同階段各個基因表達的不同,與其他差別雜交方法相比,它能進行初步篩選和鑒定,因而節(jié)省了時間;由于事先獲得了某個基因的 EST,所以可加速對該基因的克隆以及序列測定。

5 轉座子標簽 (transposon tagging)技術

轉座子是染色體上一段可以移動的DNA序列,它可以從一個基因座位轉移到另一個基因座位,當轉座子插入到某個功能基因內(nèi)部或鄰近位點時,就會使插入位置的基因失活并誘導產(chǎn)生突變型,通過遺傳分析可以確定某基因的突變是否由轉座子引起,由轉座子引起的突變可用轉座子 DNA為探針,從突變株的基因組文庫中釣取含該轉座子的 DNA片段,獲得含有部分突變株DNA序列的克隆,然后以該DNA序列為探針,篩選野生型植株的基因組文庫,最終得到完整的目的基因。該技術主要用于植物基因的克隆[13],由于可供利用的轉座子的種類太少,而轉座子在不同的植物中轉座的頻率和活性相差很大,并且需要篩選大量的個體來鑒定轉座子突變個體,限制了轉座子標簽法的應用范圍。

基因克隆的技術發(fā)展很快,種類也越來越多,但每一種方法都有它的優(yōu)勢和劣勢及適用范圍和限制因素。綜合來看,不同的克隆策略,雖主導思路不同,但常常是相互聯(lián)系相互補充的,有些過程也是共通的,因而實驗者必須根據(jù)所克隆基因的類型和實際條件選擇最佳的方案。隨著各種知識的積累,克隆基因的技術也逐步完善,速度效率也不斷提高,相信人類終將掌握大規(guī)模、快捷、經(jīng)濟基因克隆的技術,并很快將基因的研究安全地應用到實踐中去。

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[責任編校:李宜培]

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1008-9276(2010)06-0753-04

2010-06-10

劉心偉 (1983-),男,河南省駐馬店市人,學士,研究實習員,從事運動員基因選材和運動訓練生理生化監(jiān)控研究。