張濟敏,胡云霞,鄒 芳,郭寶枝,郭華峰,苑中甫,王明臣

(1.鄭州市婦幼保健院 婦科激光治療室,河南 鄭州 450053;2.鄭州大學第一附屬醫(yī)院 婦產(chǎn)科,河南 鄭州 450053;3.鄭州大學醫(yī)學院生化教研室,河南 鄭州 450053)

宮頸癌組織中SOD2基因的表達及意義

張濟敏1,胡云霞1,鄒 芳1,郭寶枝1,郭華峰1,苑中甫2,王明臣3

(1.鄭州市婦幼保健院 婦科激光治療室,河南 鄭州 450053;2.鄭州大學第一附屬醫(yī)院 婦產(chǎn)科,河南 鄭州 450053;3.鄭州大學醫(yī)學院生化教研室,河南 鄭州 450053)

目的:分析SOD2基因在宮頸浸潤癌(ICC)、宮頸上皮內瘤變(CIN)及正常宮頸上皮(NCE)組織中的mRNA表達情況,揭示氧化應激在宮頸癌發(fā)生中的可能作用。方法:應用RT-PCR分別擴增18例宮頸癌組織、20例宮頸上皮內瘤變及20例正常宮頸組織中SOD2基因片段,半定量分析其表達情況。結果:與宮頸上皮內瘤變及正常宮頸上皮相比,宮頸癌組織中SOD2基因的mRNA表達顯著下降(P＜0.05)。結論:SOD2基因表達低下導致氧化應激加劇,在宮頸癌的發(fā)生中可能起重要作用。

錳超氧化物歧化酶;宮頸癌;基因表達

宮頸癌是威脅女性生命的第二大惡性腫瘤,其發(fā)病率僅次于乳腺癌。宮頸癌發(fā)生的確切分子機制尚未充分闡明[1]。近年研究[2]表明,活性氧(ROS)參與腫瘤的啟動和促進過程。SOD2基因編碼錳超氧化物歧化酶(MnSOD),是體內主要的超氧自由基清除劑,保護細胞免受ROS的損傷。研究[3]顯示,SOD2的基因表達量伴隨細胞的癌變過程呈正相關下降,提示SOD2基因系潛在的新型腫瘤抑制基因,本研究旨在揭示SOD2基因在宮頸浸潤癌(ICC)、宮頸上皮內瘤樣變(CIN)及正常宮頸上皮(NCE)中的mRNA表達狀態(tài),以期為尋求宮頸癌基因診斷和治療的靶向基因提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 標本的收集與處理

標本取自鄭州市婦幼保健院、鄭州大學第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科宮頸活檢及手術切除的病理標本38例。受檢患者中宮頸上皮內瘤變患者(CIN)20例,其中Ⅰ級6例、Ⅱ級8例、Ⅲ級6例。宮頸浸潤癌(ICC)患者18例,全部經(jīng)術后病理檢查確診,病理分級G1～G2級12例、G3級6例;FIGO 分期Ⅰa～Ⅰb 6例、Ⅱa 6例、Ⅱb及以上6例。另取20例正常宮頸上皮(NCE)作為對照,為子宮肌瘤患者手術中切除的正常宮頸組織。所有標本取出后立即放入無RNase的EP管中并放入液氮中保存待測。

1.2 方法

1.2.1 總 RNA的提取 從液氮中取出標本組織,加液氮在研缽中研碎,用Qiagen公司總RNA提取試劑盒提取總RNA。

1.2.2 cDNA的合成 所采用的逆轉錄反應體系:RT-Mix 9 μ L(5×RT 緩沖液含 50 mmol/LMgCl26 μ L,10 mmol/L 4 ×dNTP 2 μ L,RNasin 40U,AMV 2U,通用 引物 1 μ L),提 取 總 RNA 5 μ L,DEPC水補足30 μ L,42℃水浴逆轉錄1 h。

1.2.3 PCR擴增 SOD2和β-actin擴增引物由上海生工生物公司合成。SOD2引物(上游):5′GTGGTGGTCATATCAATCAT3′,SOD2 引物(下游):5′GGCCTGT TGT TCCTTGCAGT3′,擴增產(chǎn)物長度252bp;內參照 β-actin(上游):5′ACACTGTGCCCATCTACGAGG 3′,β-actin(下游):5′CT T TGCGGATGTCCACGTC 3′,擴增產(chǎn)物長度 393bp。擴增反應體積為 30 μ L:逆轉錄所得 cDNA 5 μ L,Mix(含有SOD2引物及 β-actin內參照引物)6 μ L,T aq 酶 0.5 μ L,去離子水 18.5 μ L,94 ℃預變性5min,94℃變性50 s,55℃復性50 s,72℃延伸60 s,三溫循環(huán)35次,72℃末端延伸5min。

1.2.4 瓊脂糖凝膠電泳 配制質量分數(shù)1.5%瓊脂糖凝膠電泳(含 EB 0.5 μ g/mL),取 PCR擴增產(chǎn)物9 μ L點樣電泳,以 3V/cm 電泳 40min。使用英國SYNGENE凝膠成像分析系統(tǒng),對擴增產(chǎn)物的電泳條帶進行灰度掃描,分析測定積分吸光度值(IA)。每例標本SOD2基因mRNA的相對表達量以SOD2片段的IA/β-actin的 IA的比值表示。采用 SPSS 10.0統(tǒng)計學軟件對結果進行統(tǒng)計學處理。

2 結果

2.1 宮頸癌、宮頸上皮內瘤變及正常宮頸組織中SOD2和β-actin基因 RT-PCR擴增結果(見圖1)

圖1 SOD2基因的mRNA表達

2.2 宮頸癌、宮頸上皮內瘤變及正常宮頸組織中SOD2基因的mRNA表達量分析

宮頸癌、宮頸上皮內瘤變及正常宮頸組織中SOD2基因的mRNA表達水平()分別為0.45±0.11、0.92±0.24、1.67±0.35。宮頸癌組織中SOD2基因的mRNA表達水平較宮頸上皮內瘤變及正常宮頸上皮組織中顯著降低,統(tǒng)計學處理有顯著性差異(P＜0.05)。

3 討論

由活性氧自由基引發(fā)的氧化應激損傷在包括腫瘤在內的諸多疾病中發(fā)揮重要作用?；钚匝醢ǔ蹶庪x子自由基(O?2)、羥自由基(OH?)等。SOD是體內以O?2為唯一底物的天然酶類自由基清除劑,在保護細胞免受ROS的氧毒性損傷中發(fā)揮最重要作用。真核生物中有CuZnSOD和MnSOD 2種同工酶。SOD2基因編碼MnSOD存在于線粒體基質中。線粒體呼吸鏈電子傳遞是體內活性氧產(chǎn)生的最主要途徑,MnSOD可及時清除自由基以防止自由基的累積,因此SOD2基因的表達和調控對維系機體自由基代謝平衡至關重要。ROS還作為機體重要的信號分子,參與調控細胞的分化、增殖、凋亡等,與腫瘤的發(fā)生密切相關。研究[3]認為,MnSOD是一種新的腫瘤抑制因子,MnSOD的基因表達與腫瘤的分化程度和惡性表型相關。本研究顯示,宮頸癌中MnSOD基因的mRNA表達水平較宮頸上皮內瘤變及正常宮頸上皮組織中顯著低下,提示MnSOD的下調表達導致氧化應激加劇在宮頸癌的發(fā)生中亦起重要作用。但關于MnSOD參與腫瘤發(fā)生的機制,Huang等[4]認為腫瘤細胞MnSOD表達下降,導致細胞內ROS增加,高濃度的ROS可導致DNA氧化損傷,關聯(lián)細胞增殖轉化和腫瘤的發(fā)生。此外,MnSOD表達異?？筛淖兗毎麅劝∣?2在內的ROS的凈水平,后者作為細胞內重要的信號分子[5],調節(jié)某些轉錄因子活性,從而使細胞增殖相關的信號轉導通路發(fā)生改變,可能是MnSOD介導腫瘤發(fā)生的另一分子機制,有待深入研究。

[1]Parkin DM,Bray F,Ferlay J,et al.Global caneer statisties[J].Caneer J Clin,2005,55(2):74-108.

[2]Sun Y.Free radicals,antioxidant enzymes and carcinogenesis[J].Free Radical Biol&Med,1990,8(6):583-599.

[3]Bravard A,Sabatier L,Hoffschir F,et al.SOD2:a new type of tumor-suppressor gene?[J].Int J Cancer,1992,51(3):476-480.

[4]Huang Y,Peng J,Oberley LW,et al.Transcriptional inhibition of manganese superoxide dismutase(SOD2)gene expression by DNA methylation of the 5′-CPG island[J].Free Redical Biol Med,1997,23(2):314-320.

[5]Zhao Y,Xue Y,Oberley TD,et al.Overexpression of manganese superoxide dismutase suppresses tumor formation by modulation of activator protein-1 signaling in a multistage skin carcinogenesis mode[J].Cancer Res,2001,61(16):6082-6088.

[責任編輯 時 紅]

Gene expression and significance of manganese superoxide dismutase in cervical cancer tissue

ZHANG Ji-min1,H U Yun-xia1,ZOU Fang1,GUO Bao-zhi1,Guo Hua-feng1,YUAN Zhongfu2,WANGming-chen3(1.Zhengzhou Maternity and Child Health Care Hospital,Zhengzhou,Henan 450053,China;2.Department of Gynecology,the First A f filiated Hospital of Zhengzhou University,Zhengzhou,Henan 450053,China;3.Department of Biochemistry,Medical College of Zhengzhou University,Zhengzhou,Henan 450052,China)

Objective:To investigate the mRNA expression level of manganese-containing superoxide dismutase(SOD2)gene in human cervical cancer tissues,cervical intraepithelial neoplasia(CIN)and normal cervical epitherical(NCE)tissues and to unravel the effect of oxidative stress in the pathogenesis of cervical cancer.Methods:The level of mRNA expression of SOD2gene in 18 cases of cervical cancer tissues and 20 specimens of cervical intraepithelial neoplasia(CIN)and 20 normal cervical tissues were detected by reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR).Results:The expression level of SOD2in cervical cancer tissues significantly decreased compared with those of cervical intraepithelial neoplasia(CIN)and normal cervical tissues.Conclusion:The down regulation expression of SOD2gene,resulting in the enhancing of oxidative stress,may play an important role in the pathogenesis of cervical cancer.

manganese-containing superoxide dismutase;Cervical cancer;Gene expression

R737.33

A

1672-7606(2010)03-0188-03

2010-05-10

張濟敏(1965-),女,河南 開封 人,主管護師,從事婦科疾病物理治療工作。