鄭 紅,林 波,趙國(guó)強(qiáng),董子明*

(1.河南大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理生理教研室,河南 開(kāi)封 475004;2.鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,河南 鄭州 450052)

慢病毒載體的構(gòu)建及低表達(dá)和過(guò)表達(dá)CEA EC9706細(xì)胞株的建立

鄭 紅1,林 波1,趙國(guó)強(qiáng)2,董子明2*

(1.河南大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理生理教研室,河南 開(kāi)封 475004;2.鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,河南 鄭州 450052)

目的:構(gòu)建人癌胚抗原(CEA)慢病毒siRNA和表達(dá)載體并包裝成感染性病毒顆粒,獲得穩(wěn)定低表達(dá)和過(guò)表達(dá)CEA的EC9706細(xì)胞。方法:構(gòu)建CEA siRNA載體:依據(jù)siRNA靶序列設(shè)計(jì)原則,針對(duì)人CEA的cDNA序列,設(shè)計(jì)并合成編碼siRNA的3對(duì)寡核苷酸序列,克隆入siRNA載體(pRNA T-U6.2/Lenti)中構(gòu)建3個(gè)重組體pRNAT-U6.2-SCEA。構(gòu)建CEA表達(dá)載體:以人CEA的測(cè)序質(zhì)粒為模板,PCR擴(kuò)增CEA全長(zhǎng),裝入pLentiGFP轉(zhuǎn)移質(zhì)粒,經(jīng)過(guò)測(cè)序證實(shí)其序列與標(biāo)準(zhǔn)序列完全一致。然后進(jìn)行重組慢病毒分別感染EC9706細(xì)胞,G418篩選得到穩(wěn)定感染細(xì)胞株。分別用熒光定量Real-time RT-PCR和Western blot檢測(cè)EC9706細(xì)胞中CEA基因表達(dá)抑制或增強(qiáng)的效果。結(jié)果:EC9706病毒感染48 h后熒光顯微鏡觀察CEA慢病毒載體在細(xì)胞中高效表達(dá),經(jīng)過(guò) RTPCR和Western-blot驗(yàn)證:得到3株穩(wěn)定CEA低表達(dá)的EC9706細(xì)胞株,其中一個(gè)CEA的表達(dá)幾乎得到完全抑制,1株穩(wěn)定CEA過(guò)表達(dá)的EC9706細(xì)胞株(EC9706-CEA)。結(jié)論:建立了穩(wěn)定低表達(dá)和過(guò)表達(dá)CEA的EC9706細(xì)胞株,成功調(diào)控食管癌EC9706細(xì)胞中CEA的表達(dá),為進(jìn)一步從分子水平探討CEA的功能奠定了基礎(chǔ)。

癌胚抗原;EC9706;慢病毒載體

癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)屬于非器官特異性腫瘤相關(guān)抗原,它不僅作為一種單純的腫瘤標(biāo)志物存在,而且是與腫瘤惡性化有關(guān)的一種復(fù)雜的分子。但目前對(duì)于CEA分子水平的研究主要集中在腫瘤治療前、治療中、治療后CEA表達(dá)的變化及其與腫瘤診斷、治療、預(yù)后的關(guān)系[1-3]。CEA與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移有無(wú)內(nèi)在聯(lián)系,對(duì)治療過(guò)程有什么影響,文獻(xiàn)中未見(jiàn)深入報(bào)道。本研究利用RNA干擾和基因重組技術(shù),構(gòu)建CEA siRNA慢病毒載體,同時(shí)構(gòu)建CEA慢病毒表達(dá)載體,感染EC9706細(xì)胞,通過(guò)篩選得到低表達(dá)和過(guò)表達(dá) CEA EC9706細(xì)胞株。旨在實(shí)現(xiàn)對(duì)CEA表達(dá)的調(diào)控,為進(jìn)一步從分子水平探討CEA功能及對(duì)治療的影響打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

慢病毒包裝細(xì)胞株293FT購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司;pCMV-SPORT6-CEA質(zhì)粒購(gòu)于proteintech公司;pGEM-T Easy克隆質(zhì)粒購(gòu)于Promega公司;pLentiGFP慢病毒表達(dá)載體和輔助包裝質(zhì)粒 p△8.2、pVSV-G均由美國(guó)NIH職慧軍博士惠贈(zèng);pRNAT-U6.2/Lenti siRNA表達(dá)載體購(gòu)于GenScript公司;鼠抗人CEA單克隆抗體、鼠抗人β-actin多克隆抗體及酶標(biāo)抗鼠IgG(辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗小鼠IgG抗體)為美國(guó)Santa Cruz公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 構(gòu)建針對(duì)CEA基因的siRNA慢病毒載體設(shè)計(jì)靶向 CEA基因的寡核苷酸:利用 Takara和promega siRNA靶序列分析設(shè)計(jì)系統(tǒng),掃描人CEA cDNA編碼序列(NM_004363),根據(jù)siRNA靶序列設(shè)計(jì)原則,CEA基因siRNA靶序列最終確定為3個(gè),分別是 341-359、1155-1173和 1281-1298。分別合成3對(duì)shDNA單鏈,兩端加上BamHI和XhoI內(nèi)切酶殘基,由上海博尚生物公司合成。發(fā)卡DNA復(fù)性,純化;酶切并回收雙粘線性化pRNAT-U6.2/Lenti質(zhì)粒;退火產(chǎn)物(雙鏈發(fā)卡DNA),與雙粘線性化siRNA表達(dá)載體 pRNAT-U6.2/Lenti連接;轉(zhuǎn)化,轉(zhuǎn)板;PCR初步篩選,陽(yáng)性克隆測(cè)序鑒定。

1.2.2 構(gòu)建表達(dá)CEA基因的慢病毒載體 引物設(shè)計(jì)、合成:參考GenBank的CEA基因序列設(shè)計(jì)出1對(duì)CEA全基因擴(kuò)增引物,引物序列如下:上游,5′ACTCGAGATGGAGTCTCCCTCGGCCCCTCCC 3′;下游 ,5′CAAGCTTCTATATCAGAGCAACCCCAACCAGCAC 3′。重組慢病毒載體轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pLentiGFP-CEA的構(gòu)建、鑒定和測(cè)序:分別用 XhoL和HindⅢ雙酶切pGEM-T-CEA和慢病毒載體pLentiGFP后,膠回收得到雙粘片段和雙粘線形載體pLentiGF;將雙粘CEA片段與羥化后的雙粘線形載體pLentiGFP連接得重組載體pLentiGFP-CEA;以CEA全基因引物PCR擴(kuò)增,鑒定是否插入目的基因;提取質(zhì)粒送測(cè)序。

1.2.3 重組慢病毒包裝 制備重組體質(zhì)粒(pRNAT-U6.2/Lenti-sC341、pRNAT-U6.2/Lenti-sC-1155、pRNAT-U6.2/Lenti-sC1281及 pLentiGFP-CEA)及空載體質(zhì)粒,純化產(chǎn)物經(jīng)紫外光柵分光儀測(cè)定各質(zhì)粒濃度。分別與包裝質(zhì)粒p△8.2、pVSV-G共轉(zhuǎn)染293ET細(xì)胞;收集病毒上清,純化后測(cè)定其病毒滴度。

1.2.4 過(guò)表達(dá)和低表達(dá)CEA EC9706細(xì)胞株的建立 復(fù)蘇培養(yǎng)EC9706細(xì)胞,待細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí),分組分別加入包裝的慢病毒,相當(dāng)于每個(gè)細(xì)胞10個(gè)病毒的感染量。感染48 h后免疫熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)熒光情況。G418篩選后,建立穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株。

1.2.5 RT-PCR擴(kuò)增鑒定 收集各組重組慢病毒感染和對(duì)照未感染的EC9706,提取RNA,逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA,采用嵌合熒光檢測(cè)法,根據(jù)Real time PCR試劑盒(TaKaRa公司)與擴(kuò)增儀(ABI5700型)說(shuō)明,配制熒光定量PCR反應(yīng)體系,以CEA全基因引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。以CEA基因拷貝數(shù)與β-actin基因拷貝數(shù)比值計(jì)算其相對(duì)表達(dá)量。

1.2.6 Western-blot檢測(cè)CEA表達(dá) 分別收集各組EC9706細(xì)胞,離心沉淀后作勻漿及超聲破碎處理,并使蛋白變性;SDS-PAGE凝膠電泳樣品,當(dāng)藍(lán)色條帶消失時(shí)半干法轉(zhuǎn)移凝膠至硝酸纖維素膜(NC),封閉硝酸纖維素膜;加入人CEA單克隆抗體,4℃過(guò)夜;加入酶標(biāo)二抗,慢搖2 h,顯影,定影;用βactin作內(nèi)參照驗(yàn)證蛋白的含量。

2 結(jié)果

2.1 CEA mRNA表達(dá)檢測(cè)結(jié)果

熒光定量RT-PCR檢測(cè),各組細(xì)胞CEA mRNA表達(dá)水平,結(jié)果及比較見(jiàn)表1、圖1。EC9706-sCEA341、EC9706-sCEA1155和 EC9706-sCEA12813組細(xì)胞CEA mRNA表達(dá)都受到抑制,其中EC9706-sCEA1281組細(xì)胞的抑制效果最強(qiáng)。EC9706-CEA組細(xì)胞CEA mRNA表達(dá)明顯增強(qiáng),而2個(gè)對(duì)照組(EC9706-siCon和 EC9706-Con)細(xì)胞中都存在較高水平的CEA mRNA表達(dá),與空白對(duì)照組細(xì)胞對(duì)比CEA mRNA無(wú)顯著差異。

實(shí)驗(yàn)組1～3:感染pRNAT-U6.2/Lenti-sC341、pRNAT-U6.2/Lenti-sC1155和pRNAT-U6.2/Lenti-sC1281包裝產(chǎn)生的慢病毒顆粒,經(jīng)過(guò)G418篩選得到了3株穩(wěn)定轉(zhuǎn)染不同靶區(qū)段沉默CEA表達(dá)的EC9706細(xì)胞株,分別命名為 EC9706-sCEA341、EC9706-sCEA1155、EC9706-sCEA1281。實(shí)驗(yàn)組 4:pRNAT-U6.2/Leni空載體包裝產(chǎn)生的慢病毒顆粒感染并篩選得到的EC9706細(xì)胞株,命名為EC9706-siCon。實(shí)驗(yàn)組5:pLentiGFP-CEA包裝產(chǎn)生的慢病毒顆粒感染,并篩選得到的EC9706細(xì)胞株,命名為EC9706-CEA。實(shí)驗(yàn)組6:pLentiGFP空載體包裝產(chǎn)生的慢病毒顆粒感染并篩選得到的EC9706細(xì)胞株,命名為EC9706-Con?？瞻讓?duì)照組:未轉(zhuǎn)染的正常食管癌EC9706細(xì)胞。

表1 各組中CEA mRNA的相對(duì)含量(n=6)

表1 各組中CEA mRNA的相對(duì)含量(n=6)

注:P為各組與空白對(duì)照組比較。

實(shí)驗(yàn)1組 0.06±0.01 ＜0.01實(shí)驗(yàn)2組 0.12±0.02 ＜0.01實(shí)驗(yàn)3組 0.05±0.01 ＞0.05實(shí)驗(yàn)4組 0.17±0.01 ＞0.05實(shí)驗(yàn)5組 0.35±0.01 ＜0.01實(shí)驗(yàn)6組 0.19±0.01 ＞0.05對(duì)照組 0.18±0.02

圖1 慢病毒感染細(xì)胞CEAmRNA相對(duì)表達(dá)量比較

圖2 各組細(xì)胞CEA Western blot結(jié)果

2.2 CEA免疫印跡(Western blot)結(jié)果

6個(gè)實(shí)驗(yàn)組(EC9706-sCEA341、EC9706-sCEA1155、EC9706-sCEA1281、EC9706-siCon 、EC9706-CEA 和EC9706-Con)和未感染組(EC9706)CEA蛋白印跡結(jié)果見(jiàn)圖2。EC9706-sCEA341、EC9706-sCEA1155和EC9706-sCEA1281細(xì)胞中CEA蛋白均顯示抑制,其中EC9706-sCEA1281組細(xì)胞的抑制效果最強(qiáng),EC9706-siCon和EC9706-Con CEA細(xì)胞中都存在較高水平的CEA蛋白表達(dá),與未感染組(EC9706)對(duì)比CEA蛋白無(wú)顯著差異,而EC9706-CEA組細(xì)胞CEA蛋白與未感染組(EC9706)對(duì)比明顯增高。所有印跡出現(xiàn)位置約為180kDa處,與人CEA蛋白分子量一致。

3 討論

RNA干擾(RNA interference,RNAi)是近年發(fā)現(xiàn)的一種重要基因沉默技術(shù),又稱轉(zhuǎn)錄后基因沉默(posttranscriptional gene silencing,PTGS)[4]。RNAi技術(shù)近年來(lái)發(fā)展迅速,已成為分子生物學(xué)研究的主要技術(shù)手段之一,在功能基因組研究、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)研究及基因治療方面顯示出巨大的前景。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明根據(jù)CEA基因序列設(shè)計(jì)的短發(fā)卡狀寡核苷酸序列能特異性快速有效地封閉CEA基因的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)中設(shè)計(jì)的3個(gè)靶向siRNA寡核苷酸所達(dá)到抑制CEA表達(dá)的作用有差異,是因?yàn)橐罁?jù)siRNA設(shè)計(jì)原則常選擇起始密碼子下游第50～100個(gè)堿基以后一段cDNA序列作為靶點(diǎn),研究[5]證明針對(duì)同一基因不同位置的cDNA序列所設(shè)計(jì)的siRNA對(duì)于該基因的抑制效應(yīng)有著很大差別。本實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了這一點(diǎn),sC341、sC1281對(duì)EC9706細(xì)胞CEA均有很好的抑制作用,sC1155則抑制CEA基因的效果不好,與前兩個(gè)序列有顯著差異。

基因工程的最終目的是將外源基因轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞中高效穩(wěn)定表達(dá)。本研究所采用的慢病毒載體是近年來(lái)出現(xiàn)的一種新的基因轉(zhuǎn)移工具,多種研究[6-8]證實(shí)它可以在分裂和非分裂哺乳動(dòng)物細(xì)胞中進(jìn)行穩(wěn)定的高水平基因表達(dá),感染效率高,表達(dá)穩(wěn)定,自身抗原性弱,可操控性強(qiáng)。目前,慢病毒載體經(jīng)過(guò)不斷改造優(yōu)化,在生物安全性、病毒滴度及靶細(xì)胞嗜性范圍方面均有提高,能夠提供高效的基因轉(zhuǎn)移和長(zhǎng)期穩(wěn)定的蛋白表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)中慢病毒載體采用三質(zhì)粒系統(tǒng)進(jìn)行構(gòu)建,包括轉(zhuǎn)移質(zhì)粒、包裝質(zhì)粒和包膜蛋白質(zhì)粒,其中轉(zhuǎn)移質(zhì)粒中含有包裝、逆轉(zhuǎn)錄及整合所需的順式序列,保留多克隆位點(diǎn),在其中插入目的基因CEA;包裝質(zhì)粒在CMV啟動(dòng)子的控制下,表達(dá)病毒復(fù)制所需的全部反式激活蛋白,但不產(chǎn)生病毒包膜蛋白及輔助蛋白VPU;包膜蛋白質(zhì)粒編碼水皰性口炎病毒-G糖蛋白(VSV-G),應(yīng)用VSV-G包膜的假構(gòu)型慢病毒載體一方面降低病毒自我復(fù)制能力,提高生物安全性,另一方面拓寬與靶細(xì)胞的親合力,增加了載體的穩(wěn)定性,能夠允許通過(guò)高速離心對(duì)其進(jìn)行濃縮,提高病毒滴度和活性,使真核轉(zhuǎn)染成功率大為提高。實(shí)驗(yàn)中選用來(lái)源于人胚腎細(xì)胞系的293T包裝細(xì)胞完成對(duì)慢病毒載體三質(zhì)粒系統(tǒng)的包裝,使其在包裝過(guò)程中能反式提供產(chǎn)生病毒顆粒所需的蛋白,并且由于引入VSV-G包膜的假構(gòu)型載體,極大地提高了細(xì)胞親合性和穩(wěn)定性。

本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了CEA siRNA和表達(dá)慢病毒載體并成功地感染 EC9706細(xì)胞,經(jīng) RT-PCR擴(kuò)增和Western Blot方法從mRNA和蛋白質(zhì)水平檢測(cè)均表明獲得了穩(wěn)定低表達(dá)和過(guò)表達(dá)CEA EC9706細(xì)胞株,實(shí)現(xiàn)了對(duì)EC9706細(xì)胞中CEA表達(dá)水平的調(diào)控,為進(jìn)一步探討CEA的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

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[責(zé)任編輯 姬 荷]

Construction of lentiviral vector and establishment of stable EC9706 cell lines with lower or higher CEA expression

ZHENG Hong1,LIN Bo1,ZHAO Guo-qiang2,DONG Zi-ming2*(1.Department of Pathophysiology,Medical College of Henan University,K aifeng,Henan 475004,China;2.School of Basic Medical Science,Zhengzhou University,Zhengzhou,Henan 450052,China)

Objective:To construct CEA siRNA vector and CEA expression vector,to package lentivirus particles,and to establish stable EC9706 cell lines with lower or higher CEA expression.Methods:Construction of CEA siRNA expression vector:according to the principle of designing siRNA sequence,aimed at human CEA cDNA sequence,three DNA oligonucleotides of short hairpin RNA sequence were synthesized,three hairpin DNAs were cloned into siRNA expression vector(pRNAT-U6.2/Lenti).Construction of CEA expression vector:CEA gene sequence was amplified as target gene from plasmid which contains CEA gene by PCR,ligated with lentiviral vector plasmid pLentiGFP and verified by sequencing.And then recombinated lentivirus were produced:the esophageal carcinoma EC9706 cell lines were infected respectively by lentivirus particles,the infected stable cell lines were established by G418 screening.The silencing and reinforcing expression of CEA was detected by real time RT-PCR and Western blotting.Results:The recombinant lentivirus high expression in EC9706 cells was observed through fluorescence microscope after 48h infection,verificated by real-time RT-PCR and Western-blot:Three stable EC9706 cell lines with lower CEA expression were established,among them,one was the best,its CEA expression was about completely depressed.Meanwhile EC9706 cell line with CEA overexpression was also established.Conclusion:Stable EC9706 cell lines with lower or higher CEA expression are established,CEA expression in EC9706 cells are successfully regulated.This facilitates further functional studies of CEA atmolecular level.

CEA;EC9706;Lentiviral vector

R73.3

A

1672-7606(2010)03-0160-04

2010-06-20

教育部科技創(chuàng)新工程重點(diǎn)項(xiàng)目(207150)

鄭紅(1970-),女,河南 開(kāi)封 人,博士,副教授,從事腫瘤的發(fā)病機(jī)制及生物治療的研究。

*通訊作者:董子明(1953-),男,河南寶豐人,教授,博士生導(dǎo)師,從事分子腫瘤學(xué)研究。