唐璟群綜述,晏 勇審校

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科/重慶市神經(jīng)病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 400016)

阿爾茨海默病(Alzheimer′s Disease,AD)是老年人群中最常見的進(jìn)行性神經(jīng)變性疾病,主要臨床表現(xiàn)為進(jìn)行性認(rèn)知及記憶功能喪失、精神行為異常等,是繼冠心病、腫瘤和卒中之后的第4位主要死亡原因。AD主要病理學(xué)特征是細(xì)胞外老年斑沉積、細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)原纖維纏結(jié)和神經(jīng)元丟失等。其病因多樣、發(fā)病機(jī)制復(fù)雜。目前廣泛認(rèn)同AD發(fā)生的核心機(jī)制是β-淀粉樣蛋白(Aβ)沉積。過去主要圍繞Aβ生成增多和異常沉積的研究已碩果累累,揭示了多種蛋白酶類代謝異常和分子調(diào)控通路異常,而對(duì)Aβ降解減少導(dǎo)致過度沉積在AD發(fā)病中的作用研究較少。近年來部分研究揭示降解Aβ的酶主要有腦啡肽酶(Neprilysin,NEP)、胰島素降解酶(IDE)、內(nèi)皮素轉(zhuǎn)換酶-1(ECE-1)和內(nèi)皮素轉(zhuǎn)換酶-2(ECE-2)等,其中NEP是腦實(shí)質(zhì)內(nèi)最主要的Aβ降解酶?，F(xiàn)將近年來的研究進(jìn)展綜述如下。

1 NEP的生化特性

NEP(也稱EC 3.4.24.11)位于細(xì)胞表面,屬中性內(nèi)肽酶M13家族中1個(gè)含鋅離子的Ⅱ型膜蛋白,相對(duì)分子質(zhì)量為97×103D,包括1個(gè)短的N-末端胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域、1個(gè)跨膜螺旋和1個(gè)大的C-末端胞外催化結(jié)構(gòu)域,其細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域有1個(gè)與催化作用有關(guān)的Zn2+結(jié)合序列(HExxH)的活性位點(diǎn)及參與二硫鍵構(gòu)成的12個(gè)半胱氨酸殘基[1-3]。NEP廣泛分布于哺乳動(dòng)物的腎臟、前列腺、睪丸、肺等組織中。用放射性自顯影技術(shù)及酶活性檢測(cè)發(fā)現(xiàn),在腦內(nèi)NEP主要分布于尾狀核、蒼白球、黑質(zhì)、嗅球和脈絡(luò)叢部位,在海馬、大腦皮質(zhì)、上下丘腦、杏仁核和中央灰質(zhì)等部位次之。NEP由神經(jīng)元內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及高爾基體內(nèi)合成并成熟,經(jīng)軸突轉(zhuǎn)運(yùn)至分泌囊泡及突觸前膜表面[4]。作為胞外酶,其水解作用發(fā)生在疏水氨基酸殘基的氨基側(cè),優(yōu)先水解細(xì)胞外小于5×103D的寡肽(5～40個(gè)氨基酸殘基)。NEP對(duì)相對(duì)分子質(zhì)量較小的 Aβ(含 40～42個(gè)疏水氨基)的降解具有重要作用。在體外實(shí)驗(yàn)中NEP能降解多種生物活性肽,如腦啡肽、生長(zhǎng)抑素、膽囊收縮素、心房利鈉肽、緩激肽、內(nèi)皮素和P物質(zhì)等,但在體內(nèi)試驗(yàn)中僅有 NEP降解Aβ的證據(jù)[3]。

2 NEP與AD發(fā)病機(jī)制的研究

2.1 NEP與Aβ的分解代謝 Aβ由經(jīng)軸突轉(zhuǎn)運(yùn)的淀粉樣前體蛋白(APP)在突觸前膜經(jīng)過β-分泌酶(BACE1)及γ-分泌酶共同裂解產(chǎn)生。有兩種構(gòu)像,一種是難溶性的β折疊(Aβ ac),能迅速生成淀粉樣沉積;另一種是可溶性的螺旋形結(jié)構(gòu)(Aβnac),很難形成淀粉樣纖維。Aβ纖維化后形成淀粉樣沉積,產(chǎn)生神經(jīng)毒性,或直接導(dǎo)致神經(jīng)元功能障礙。Aβ在腦內(nèi)被合成和降解,其穩(wěn)態(tài)水平取決于合成和分解代謝間的平衡。研究揭示,隨著年齡的增加NEP的活性下調(diào)、NEP基因缺陷或敲除該基因或于APP轉(zhuǎn)基因鼠腦內(nèi)注入NEP抑制劑等均引起Aβ降解減少而導(dǎo)致Aβ沉積和記憶損害,說明腦內(nèi)NEP的主要特定功能之一是調(diào)節(jié)Aβ的分解代謝。Li等[5]持續(xù)3 d向小鼠腦室內(nèi)注入NEP抑制劑——四氫噻吩,發(fā)現(xiàn)海馬區(qū)內(nèi)源性Aβ 40及Aβ42的不溶性片段沉積,且在 Morris水迷宮試驗(yàn)、物體識(shí)別試驗(yàn)和聯(lián)想學(xué)習(xí)試驗(yàn)方面均表現(xiàn)出明顯的學(xué)習(xí)及認(rèn)知功能受損。Hemming等[6]將由慢病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染NEP基因的原始成纖維細(xì)胞注入已形成淀粉樣斑的APP轉(zhuǎn)基因鼠腦內(nèi),發(fā)現(xiàn)細(xì)胞移植位點(diǎn)及海馬區(qū)內(nèi)的淀粉樣斑數(shù)量明顯減少。El-Amouri等[7]使用慢病毒載體作為基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)在APP/ΔPS1轉(zhuǎn)基因鼠皮質(zhì)及海馬區(qū)過度表達(dá)人NEP,4個(gè)月后檢測(cè)結(jié)果顯示,腦內(nèi)淀粉樣斑的數(shù)量減少了50%;左側(cè)大腦半球Aβ40及 Aβ42的濃度分別降低了33%及40%,說明NEP的過度表達(dá)對(duì)增強(qiáng)Aβ降解、減少Aβ沉積及老年斑形成起了重要作用。Spencer等[8]向6個(gè)月齡的APP轉(zhuǎn)基因鼠雙側(cè)大腦半球注入慢病毒載體介導(dǎo)的NEP(LV-NEP),6個(gè)月后經(jīng)免疫印記分析發(fā)現(xiàn),APP轉(zhuǎn)基因鼠腦皮質(zhì)及海馬區(qū)NEP表達(dá)較對(duì)照組明顯增高、活性增強(qiáng)。神經(jīng)病理檢查顯示長(zhǎng)達(dá)6個(gè)月的LV-NEP治療可減少轉(zhuǎn)基因鼠皮質(zhì)區(qū)48%和海馬區(qū)25%淀粉樣物質(zhì)沉積。

Guan等[9]通過慢病毒移植骨髓細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo),在3xAg-AD鼠(129/C57Bl6/CD45.2)中成功地將NEP表達(dá)在白細(xì)胞表面,使Aβ降解為相對(duì)分子質(zhì)量更小且無害的肽片段,促進(jìn)Aβ從腦內(nèi)向血漿運(yùn)送及阻止外周血中的Aβ再進(jìn)入腦內(nèi),最終使腦內(nèi)Aβ水平降低了約30%,Aβ沉積物減少了50%～60%。Mohajeri和Wolfer[10]最近將敲除編譯NEP的等位基因 Mme及過度表達(dá)人APP的雙突變小鼠與APP基因改造鼠相比較,發(fā)現(xiàn)雙突變鼠表現(xiàn)明顯的淀粉樣變性,且在Morris水迷宮學(xué)習(xí)記憶及條件性厭食試驗(yàn)中均有明顯的認(rèn)知功能損害。這表明即使NEP的部分缺乏(如同人類的老齡化過程),亦加劇了淀粉樣變性的病理,并可能損害認(rèn)知功能。

2.2 NEP的分布與Aβ的沉積 NEP在腦內(nèi)的分布范圍與Aβ的沉積區(qū)域呈反向關(guān)系,即Aβ的沉積區(qū)域內(nèi)NEP分布最少。Iwata等[11]研究發(fā)現(xiàn),NEP基因部分缺陷或活性部分下調(diào)均可引起內(nèi)外源性Aβ的降解不足,導(dǎo)致Aβ過度沉積。在NEP基因缺乏的小鼠腦內(nèi),Aβ區(qū)域性分布在海馬、大腦皮質(zhì)、丘腦/紋狀體、小腦,其中海馬區(qū)含量最高,小腦最少,與 Aβ在AD患者腦內(nèi)的分布一致。Fukami等[12]研究發(fā)現(xiàn),NEP在海馬區(qū)主要分布于CA1～3區(qū)的網(wǎng)狀分子層及齒狀回分子層,其次分布在透明層、齒狀回多形細(xì)胞層、顆粒層以及海馬錐體細(xì)胞層,而在CA1～3區(qū)的始層、輻射層及下腳最少。相反,Aβ則主要出現(xiàn)在NEP分布較少的CA1～3區(qū)的始層、輻射層及下腳。

Takeuchi等[13]用免疫組化分析研究不同年齡段的狗與貓腦內(nèi)的NEP表達(dá)、活性及與Aβ的分布關(guān)系,發(fā)現(xiàn)在腦內(nèi)NEP主要分布于尾狀核、殼核、蒼白球及黑質(zhì),其次為大腦皮質(zhì),而白質(zhì)、小腦和海馬幾乎無NEP分布,各年齡段間無明顯差別。在狗與貓腦內(nèi)的NEP活性由高到低排列為丘腦/紋狀體、大腦皮質(zhì)、海馬、白質(zhì)。同時(shí),他們研究 7歲和 9個(gè)月的狗及 10歲的貓腦內(nèi)Aβ的沉積發(fā)現(xiàn),年齡越大Aβ沉積的數(shù)量與頻率越高,且以彌漫沉積或彌漫性老年斑這兩種形式主要沉積在大腦海馬區(qū)及皮質(zhì),而白質(zhì)、尾狀核、殼核、蒼白球、黑質(zhì)及小腦內(nèi)無Aβ沉積。研究結(jié)果顯示腦內(nèi) NEP與 Aβ的分布存在互補(bǔ)關(guān)系。

2.3 NEP減少Aβ所致的神經(jīng)損傷 NEP的正常表達(dá)可有效地降解Aβ,減少 Aβ過度沉積所致的神經(jīng)損傷。El-Amouri等[14]于2007年研究體外慢病毒載體介導(dǎo)的NEP過度表達(dá)保護(hù)神經(jīng)元細(xì)胞免受Aβ毒性的效能。通過檢測(cè)細(xì)胞的生存率,發(fā)現(xiàn)在表達(dá)人NEP的海馬神經(jīng)元HT22(HT22-hNEP)細(xì)胞中,經(jīng)不同濃度的 Aβ1-40和 Aβ 1-42處理后,神經(jīng)元細(xì)胞的生存能力均明顯增強(qiáng)。由此推論,給AD患者腦內(nèi)Aβ聚集的區(qū)域移植NEP基因就可減輕Aβ對(duì)神經(jīng)元的毒性效應(yīng),可望成為AD治療的靶點(diǎn)。

2.4 NEP改善 Aβ所致的空間記憶功能受損 NEP是 Aβ的主要降解酶,可減少老年斑的形成及相關(guān)神經(jīng)病理改變和臨床癥狀。Huang等[4]于 2006年將APP轉(zhuǎn)基因鼠(APP23)與NEP缺乏鼠雜交(NEP-/-APP+),用Y型迷宮、物體識(shí)別試驗(yàn)、Morris水迷宮、條件恐懼學(xué)習(xí)等學(xué)習(xí)和記憶模型檢測(cè)13～16周齡NEP-/-APP+鼠的空間工作記憶、視覺識(shí)別記憶、采集和保留相關(guān)記憶、聯(lián)想記憶等,結(jié)果發(fā)現(xiàn)NEP-/-APP+鼠與海馬區(qū)相關(guān)的認(rèn)知功能均表現(xiàn)明顯的損害。El-Amouri等[7]研究發(fā)現(xiàn)6～8個(gè)月齡的APP/ΔPS1轉(zhuǎn)基因鼠存在大量的淀粉樣斑沉積與空間記憶功能損害。而給腦內(nèi)注入慢病毒載體介導(dǎo)的人NEP及綠色熒光蛋白的APP/ΔPS1轉(zhuǎn)基因鼠在4個(gè)月后的Morris水迷宮試驗(yàn)的空間學(xué)習(xí)及記憶能力等方面較對(duì)照組明顯增強(qiáng)。

3 影響NEP的因素

圍繞AD特征性病理改變進(jìn)行的多種研究發(fā)現(xiàn)高齡、基因突變、糖代謝異常、脂代謝異常、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、雌激素缺失、神經(jīng)肽能神經(jīng)遞質(zhì)功能缺損等多個(gè)環(huán)節(jié)參與AD的發(fā)病[15]。此外,亦有因素,如人參皂苷 Rg3、生長(zhǎng)抑素、HIV-1 Tat等通過影響NEP的活性及表達(dá),分別從不同的方向調(diào)控NEP表達(dá),進(jìn)而影響AD的發(fā)生發(fā)展,成為AD治療策略的研究熱點(diǎn)。

3.1 上調(diào)NEP的因素

3.1.1 人參皂苷Rg3 人參皂苷Rg3對(duì)脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的多種細(xì)胞株中 NEP表達(dá)影響的多項(xiàng)研究表明,人參皂苷Rg3可減輕LPS對(duì)細(xì)胞內(nèi)NEP表達(dá)的抑制,增加細(xì)胞內(nèi)NEP的表達(dá),對(duì)LPS造成的細(xì)胞毒性具有一定的保護(hù)作用,提示該物質(zhì)有可能成為NEP的激活劑用于治療AD。Yang等[16]于2009年研究在轉(zhuǎn)染了瑞典突變的APP(SweAPP)的SK-N-SH細(xì)胞中人參皂苷Rg3對(duì)NEP的影響。免疫印跡發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rg3以濃度依賴及時(shí)間依賴方式通過G-蛋白偶聯(lián)受體介導(dǎo)的信號(hào)通路,明顯增加NEP基因的表達(dá),實(shí)時(shí)PCR分析發(fā)現(xiàn),人參皂苷Rg3主要通過影響NEP轉(zhuǎn)錄水平增加其活性,進(jìn)而明顯降低Aβ 40及 Aβ42的水平,改善AD的神經(jīng)損傷及認(rèn)知損害。

3.1.2 生長(zhǎng)抑素 生長(zhǎng)抑素是一種神經(jīng)肽,通過G-蛋白偶聯(lián)受體信號(hào)通路起作用,其在腦內(nèi)水平隨著年齡增長(zhǎng)而明顯下降。Saito等[17]于2005年進(jìn)行的體外實(shí)驗(yàn)顯示,生長(zhǎng)抑素可上調(diào)NEP的活性,且呈劑量依賴性增強(qiáng),但是生長(zhǎng)抑素缺乏不會(huì)引起NEP的mRNA和蛋白水平降低。根據(jù)體外實(shí)驗(yàn)推測(cè)生長(zhǎng)抑素對(duì)NEP調(diào)節(jié)可能是通過翻譯后過程,如增加NEP代謝和細(xì)胞定位等。Hama和Saido[18]于2005年為確定生長(zhǎng)抑素在體內(nèi)是否調(diào)節(jié)NEP的活性,測(cè)定了敲除生長(zhǎng)抑素小鼠腦組織中的NEP,發(fā)現(xiàn)在海馬及顳葉皮質(zhì)區(qū)NEP活性明顯下降,Aβ l-42的濃度增高了50%。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)表明,生長(zhǎng)抑素可以通過影響NEP的表達(dá)及突觸前定位調(diào)節(jié)NEP活性,并引起腦內(nèi)Aβ1-42濃度區(qū)域選擇性降低。Aβ25-35是 Aβ1-40降解產(chǎn)生的毒性片段,生長(zhǎng)抑素受體(SSTR)是生長(zhǎng)抑素的神經(jīng)調(diào)節(jié)信號(hào),Burgos-Ramos等[19]于2008年研究發(fā)現(xiàn)向鼠腦室內(nèi)注入Aβ25-35明顯降低顳葉皮質(zhì)生長(zhǎng)抑素樣免疫反應(yīng)及生長(zhǎng)抑素受體亞型-2(SSTR2)的mRNA和蛋白水平,其水平的降低能影響生長(zhǎng)抑素上調(diào)NEP的活性,促進(jìn)Aβ沉積。

3.2 下調(diào)NEP的因素

3.2.1 缺氧及氧化應(yīng)激 除老年期隨年齡增加NEP活性逐漸降低外,一些常見的腦部病理改變,如缺氧、中風(fēng)、創(chuàng)傷等也與此有關(guān)。一些研究證明缺血、缺氧引起腦內(nèi)NEP的分泌與活性降低。Nalivaeva等[20]研究短暫性腦缺血發(fā)作(TIA)和缺氧對(duì)NEP的影響,發(fā)現(xiàn)缺血、缺氧條件下 NEP的水平降低,再灌注后部分回復(fù)到原水平。產(chǎn)前輕度缺氧導(dǎo)致產(chǎn)后紋狀體NEP表達(dá)水平下降,缺氧預(yù)處理通過血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)及其受體(VEGFR-2)途徑可起到神經(jīng)保護(hù)作用。長(zhǎng)期缺氧影響酶活性,進(jìn)而引起基因表達(dá)及蛋白合成的變化,Fisk等[21]通過比較缺氧及氧化應(yīng)激對(duì)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤NB7細(xì)胞NEP表達(dá)的影響,發(fā)現(xiàn)慢性缺氧導(dǎo)致NEP mRNA水平降低40%、蛋白水平降低 25%,而氧化應(yīng)激分別為20%、30%。

3.2.2 HIV-1 Tat 因人類免疫缺陷病毒(HIV)相關(guān)性癡呆(HIV-associated dementia,HAD)具有與AD的Aβ沉積所致相同神經(jīng)病理學(xué)改變,近年來備受關(guān)注。HAD腦內(nèi)存在某些細(xì)胞因子如白介素-1、IFN-α、TNF-α等可以增加γ-分泌酶的活性,從而促進(jìn)APP裂解為毒性Aβ片段。HIV-1基因能夠編碼一種被稱為反式轉(zhuǎn)錄激活因子(transactivator of transcription,Tat)的蛋白,它是由2個(gè)外顯子構(gòu)成的非糖基化蛋白,在HIV復(fù)制過程中起重要的作用。Rempel和Pulliam[22]利用人腦神經(jīng)細(xì)胞膜的聚合分?jǐn)?shù)通過熒光檢測(cè)分析Tat對(duì)NEP的抑制活性。Tat半胱氨酸豐富結(jié)構(gòu)域通過共價(jià)鍵與NEP的活性位點(diǎn)相結(jié)合形成二聚體,起到抑制NEP降解Aβ的活性作用。體外研究發(fā)現(xiàn),Tat蛋白可抑制80%NEP活性。將重組Tat直接注入腦培養(yǎng)基中,導(dǎo)致可溶性Aβ增加125%。研究人員又對(duì)14例HIV-1感染者和5例年齡相仿的對(duì)照者的尸檢腦組織切片進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn)前者腦中Aβ明顯多于后者。進(jìn)一步的分析顯示,Aβ負(fù)荷與HIV-1感染病程明顯相關(guān),而與年齡無關(guān),這就預(yù)示著當(dāng)同齡健康人的腦中僅有少量或尚無Aβ積聚的時(shí)候,HIV感染者就可能已經(jīng)存在極高負(fù)荷的Aβ,推測(cè)這與Tat抑制NEP的活性有關(guān)。為進(jìn)一步研究Tat與NEP的關(guān)系,將Tat蛋白切割成 17個(gè) Tat多肽(每個(gè)多肽含15個(gè)氨基酸殘基),熒光分析法研究顯示這些多肽中含KCCF氨基酸序列的多肽在抑制NEP方面起主導(dǎo)作用。Daily等[23]通過觀察HIV感染(包括HIV-1血清學(xué)陽性)患者腦內(nèi) Aβ沉積變化探討Tat抑制NEP的效應(yīng),發(fā)現(xiàn)源自Tat的半胱氨酸豐富區(qū)的多肽可明顯抑制NEP,出現(xiàn)淀粉樣物質(zhì)沉積。這種抑制作用是競(jìng)爭(zhēng)性和可逆性的,其抑制的機(jī)制目前尚不清楚。有學(xué)者認(rèn)為是Tat的半胱氨酸豐富區(qū)與NEP Zn2+結(jié)合序列的活性位點(diǎn)通過非共價(jià)鍵相結(jié)合而抑制NEP的活性。

4 展 望

AD是一種以進(jìn)行性高級(jí)認(rèn)知功能障礙和記憶功能喪失為特征的疾病[24],其發(fā)病率隨年齡增長(zhǎng)而增加,65歲以上者約為5%。在AD的發(fā)病機(jī)制中,Aβ的降解及清除與Aβ形成和沉積具有同等重要作用。維持Aβ正常降解及清除能力的初步研究展示了希望,特別是通過病毒載體介導(dǎo)的NEP基因轉(zhuǎn)染或細(xì)胞移植可上調(diào)NEP的活性,明顯減少Aβ的沉積數(shù)量及速度,減輕Aβ所致的神經(jīng)變性損傷,有望成為AD的治療新靶點(diǎn)。但基因轉(zhuǎn)染后NEP活性的有效持續(xù)時(shí)間、NEP過度表達(dá)后是否對(duì)機(jī)體帶來不利影響等問題還需要在不同動(dòng)物尤其在靈長(zhǎng)類動(dòng)物中進(jìn)行深入研究。

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