祖立闖,王金良,李 嬌,沈志強,*

(1.山東綠都生物科技有限公司,山東濱州 256600;2.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院,山東濱州 256600)

膠體金免疫層析技術(shù)在動物疫病診斷上的應(yīng)用*

祖立闖1,王金良2,李 嬌1,沈志強1,2*

(1.山東綠都生物科技有限公司,山東濱州 256600;2.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院,山東濱州 256600)

膠體金免疫層析技術(shù)是在膠體金標記技術(shù)、免疫檢測技術(shù)和層析分析技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新型免疫學(xué)診斷技術(shù)。因其具有簡便、快速、無污染、不需特殊儀器、特異性強、敏感性高、結(jié)果判斷直觀等優(yōu)點,成為當前廣泛采用的動物疫病免疫學(xué)診斷技術(shù)。膠體金免疫層析技術(shù)在動物病毒病、細菌病、寄生蟲病及水產(chǎn)動物疫病診斷方面都有非常廣泛的應(yīng)用,在未來的動物疫病診斷中將發(fā)揮越來越重要的作用。論文就膠體金免疫層析技術(shù)在動物疫病診斷上的應(yīng)用進行綜述。

膠體金免疫層析;動物疫病;診斷

自1971年Faulk WP和Taylor G M用兔抗沙門菌抗血清與膠體金顆粒結(jié)合,制備成金標抗體檢測細菌表面抗原的分布[1],將膠體金首次引入免疫化學(xué)后,膠體金免疫標記技術(shù)(immunogold labelling techique)成為繼熒光素標記、放射性同位素標記和酶標記之后發(fā)展起來的一種新型的固相免疫標記技術(shù)[2]。30多年來,膠體金免疫標記技術(shù)得到不斷的發(fā)展和成熟,在醫(yī)學(xué)、農(nóng)牧業(yè)、環(huán)保及食品安全領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。該技術(shù)在動物疫病診斷方面的應(yīng)用雖然起步較晚,但發(fā)展迅速。其中,膠體金免疫層析技術(shù)(gold immunochromatography assay,GICA)由于具有簡便、快速、特異、靈敏等優(yōu)點,已成為當前動物疫病檢測中最簡單、快速、敏感的免疫學(xué)檢測技術(shù)之一,特別適合于廣大基層獸醫(yī)人員以及大批量檢測和大面積普查等,有巨大的發(fā)展?jié)摿蛷V闊的應(yīng)用前景[3]。本文就膠體金免疫層析技術(shù)(GICA)在動物疫病快速檢測上的應(yīng)用現(xiàn)狀及發(fā)展前景做一簡要綜述。

1 膠體金免疫層析技術(shù)的原理

膠體金免疫標記技術(shù)是以膠體金作為示蹤標志物應(yīng)用于抗原抗體的一種新型的免疫標記技術(shù)。它主要利用了金顆粒具有高電子密度的特性,在金標蛋白結(jié)合處,在顯微鏡下可見黑褐色顆粒,當這些標記物在相應(yīng)的配體處大量聚集時,肉眼可見紅色或粉紅色斑點,因而用于定性或半定量的快速免疫檢測方法中[4]。免疫層析(immunochromatography,IC)技術(shù)是出現(xiàn)于20世紀80年代初期的一種將免疫技術(shù)和色譜層析技術(shù)相結(jié)合的基礎(chǔ)上建立的一種簡單、快速的免疫學(xué)檢測技術(shù)[5]。膠體金免疫層析技術(shù)(GICA)是一種將膠體金標記技術(shù)、免疫層析技術(shù)等多種方法有機結(jié)合在一起的固相標記免疫檢測技術(shù)[3]。它的原理是以條狀纖維層析材料為固相,通過毛細作用使樣品溶液在層析條上泳動,并同時使樣品中的待測物與層析材料上針對待測物的受體(抗原或抗體)發(fā)生高特異性、高親和性的免疫反應(yīng),層析過程中免疫復(fù)合物被富集或截留在層析材料的一定區(qū)域(檢測帶),運用可目測的標記物(膠體金)而得到直觀的實驗現(xiàn)象(顯色),而游離標記物則越過檢測帶,與結(jié)合標記物自動分離。膠體金免疫層析技術(shù)(GICA)就是利用膠體金本身的顯色特點結(jié)合免疫層析技術(shù)而達到檢測的目的,層析時使用膠體金這種標記物,標記物與待測物的絡(luò)合物被相應(yīng)的配體捕獲而濃集顯色,以纖維膜上顯色帶的有無進行快速檢測[6]。

2 膠體金免疫層析技術(shù)的特點

膠體金免疫層析技術(shù)(GICA)在診斷技術(shù)中的迅速崛起主要是因為與其他檢測方法相比較,存在著多方面的臨床檢測優(yōu)點。

2.1 檢測面廣

膠體金免疫層析技術(shù)(GICA)既可用于檢測抗原,也可用于檢測抗體。廣泛應(yīng)用于動物疫病快速診斷和獸藥殘留快速檢測等領(lǐng)域。

2.2 操作方便

具有操作步驟簡單、無需特殊儀器、樣本無需特殊處理、檢測結(jié)果可直接用肉眼判讀等特點,對操作人員無特殊技能要求。

2.3 快速

一般只要5 min～10 min就會出檢測結(jié)果,相比其他方法,如ELISA 需1 h～2 h,PCR需3 h～4 h,大大的縮短了檢測時間,這是目前其他快速檢測方法所無法達到的。

2.4 靈敏

采用高質(zhì)量的單克隆抗體,快速診斷分析檢測下限可以達到10 pg。利用金顆?？纱呋y離子還原成金屬銀這一原理,采用銀顯影劑增強金顆粒的可見性,大大提高了測定的靈敏度,可以超過ELISA的靈敏度水平。

2.5 特異

膠體金大多用于單克隆抗體標記,對組織細胞的非特異性吸附作用小,故具有較高的特異性。

2.6 方便

由于膠體金標記蛋白質(zhì)是一物理結(jié)合過程,結(jié)合牢固,很少引起蛋白質(zhì)活性改變,所以試劑非常穩(wěn)定,不受溫度等外界因素影響,可隨身攜帶,隨時檢測,檢測結(jié)果也可長期保存。

2.7 經(jīng)濟實用

因為具有“免疫濃縮”效應(yīng),檢測所需試劑和樣本量很少,樣本量可低至100 μ L,再加上無需任何儀器和設(shè)備,并且可單份標本檢測,使檢測成本大幅下降。

2.8 安全環(huán)保

因為沒有諸如放射性同位素、鄰苯二胺等有害物質(zhì)參與,所以既不會損害操作者健康,也不會污染環(huán)境,具有放射性同位索或酶標等檢測方法所無法比擬的安全性。

3 膠體金免疫層析技術(shù)在動物病毒病檢測中的應(yīng)用

Oh J S等[7]建立了檢測犬瘟熱病毒抗體的膠體金免疫層析方法,通過檢測臨床的386份樣品,得出GICA相對于血凝抑制試驗(HI)的敏感性為97.1%,特異性為76.6%。Joon Tam Y等[8]研制了檢測偽狂犬病病毒抗原的膠體金試紙條,該試紙條檢測時只需25 μ L樣品,5 min即可出檢測結(jié)果,與常見豬病不發(fā)生交叉反應(yīng)。Peng D等[9]在家禽禽流感病毒檢測中,對膠體金免疫層析試紙條、血凝抑制試驗、瓊脂凝膠免疫擴散試驗進行了比較,得出膠體金免疫層析試紙條具有敏感性高、特異性強、簡便、快速、價格低等優(yōu)點,是家禽流感病毒快速檢測的最有效技術(shù)。Kameyama K等[10]建立了快速檢測BVDV抗原的膠體金免疫層析試紙條,該方法與病毒分離鑒定的敏感性和特異性分別為100%和97.2%,為BVDV的快速診斷提供了一種有效的檢測方法。Cui S J等[11]建立了檢測H5亞型禽流感病毒抗體膠體金試紙條,將該試紙條與HI相比較,敏感性和特異性分別為88.8%和97.6%,并且認為該方法簡便快速、不需儀器設(shè)備,必將在現(xiàn)地H5N1亞型禽流感病毒抗體的檢測中得到廣泛的應(yīng)用。徐一鳴等[12]用親和層析法純化的禽流感病毒(AIV)H3和H7亞型單克隆抗體包被膠體金,依次將純化的馬抗H3和H7亞型AIV多克隆抗體和山羊抗鼠二抗分別包被于硝酸纖維素(NC)膜上作為檢測線和質(zhì)控線,建立了鑒別檢測H3和H7亞型禽流感病毒膠體金免疫層析試紙條,用該試紙條對H3和H7亞型AIV標準抗原、畢赤酵母真核表達蛋白和已知樣品進行檢測,結(jié)果與 HA、AC-ElISA和RT-PCR方法相符。彭伏虎等[13-14]在建立H9亞型禽流感病毒膠體金免疫層析檢測方法的基礎(chǔ)上組裝成了試劑盒,試劑盒由試紙條、稀釋液、樣品管、塑料吸管、一次性手套及說明書組成,對試劑盒的特異性、敏感性、保存期和重復(fù)性等進行的測定表明,試劑盒在室溫可以保存6個月,4℃可以保存12個月,與HA試驗相比特異性強、靈敏度高、重復(fù)性好、操作簡單、方便、快捷,能在10 min內(nèi)準確檢測出樣品中是否含有H9亞型禽流感病毒,用該試劑盒對武漢市及周邊地區(qū)的雞場共抽檢498份樣品,經(jīng)病毒分離鑒定準確率達到100%。徐葛林等[15]用膠體金標記抗狂犬病病毒單抗建立的檢測狂犬病毒的膠體金免疫層析法,只與狂犬病毒抗原有特異性反應(yīng),與乙型腦炎病毒、正常小鼠腦組織等無交叉反應(yīng),檢測48份可疑狂犬病犬唾液樣品,同酶聯(lián)免疫試驗(EIA)的符合率為88.2%,該診斷試紙條非常適用于野外對動物腦或唾液中的狂犬病病毒抗原的檢測。李希友等[16]用膠體金標記新城疫病毒(NDV)抗原,兔抗NDV抗體和NDV抗原分別包被到NC膜的檢測線和質(zhì)控線上,研制出了半定量快速測定新城疫抗體的膠體金免疫層析試紙條。鄭鳴等[17]用膠體金分別標記豬瘟強、弱毒抗原,應(yīng)用雙抗原夾心法于國內(nèi)首先建立了區(qū)分豬瘟強、弱毒抗體的膠體金免疫層析試紙條,該方法操作簡單、靈敏度高、特異性好、能區(qū)分強弱毒感染,適合豬瘟的臨床診斷。蔣韜等[18]以純化的豚鼠抗O型FMDV多克隆抗體制備為金標探針,兔抗O型FMDV多克隆抗體和羊抗豚鼠IgG分別標記于硝酸纖維素膜上作為檢測帶和質(zhì)控帶,研制了O型口蹄疫病毒免疫層析試紙條,靈敏度與特異性試驗結(jié)果顯示:試紙條最高可檢測到1∶256倍稀釋的O型標準鼠抗原,靈敏度略高于反向間接血凝試驗。王中力等[19]標記純化的犬細小病毒單克隆抗體建立了檢測犬細小病毒的膠體金免疫層析法,檢測收集到120份犬糞便樣品,其結(jié)果與HA結(jié)果相對比,HA效價在1∶40以上時試紙條均能檢測到陽性結(jié)果,與犬瘟熱病毒及犬傳染性肝炎病毒無交叉反應(yīng)。王慧杰等[20]引用膠體金標記PCV-2重組Cap蛋白制備了檢測豬圓環(huán)病毒2型Cap抗體的膠體金快速診斷試紙條,試驗結(jié)果表明該試紙條特異性高,能夠區(qū)分PCV-2的標準陰、陽性血清,用該試紙在檢測來自不同豬場的165份送檢血清,與間接免疫熒光符合率在 85%以上。國內(nèi),檢測豬藍耳病病毒抗體、牛白血病病毒抗體、動物狂犬病毒抗體、新城疫病毒抗原、禽流感病毒抗原的免疫膠體金試紙條均已研制成功并申請了專利。

4 膠體金免疫層析技術(shù)在動物細菌病檢測中的應(yīng)用

Suzuki T等[21]通過對試紙條和PCR的比較,得出膠體金免疫層析方法簡便、快速、準確、安全且同樣具有良好的特異性和敏感性。Soo P C等[22]建立了檢測結(jié)核分支桿菌的膠體金層析試紙條,臨床評價試驗證實,建立的膠體金免疫層析方法簡便、快速、具有良好的特異性和敏感性、該診斷試紙條非常適用于野外及基層獸醫(yī)實驗室使用。檀華等[23]將膠體金標記葡萄球菌蛋白A,用類鼻疽多糖抗原包被NC膜,組裝成免疫層析試紙條檢測類鼻疽假單胞桿菌,用該試紙條和間接血凝試驗檢測了3份兔血清、16份豬血清和26份人血清標本,試驗表明,試紙條與間接血凝試驗的結(jié)果一致,具有較好的特異性和敏感性。張書環(huán)等[24]建立的牛分支桿菌抗體膠體金快速檢測技術(shù),交叉試驗證明該種試紙條不與牛的其他非相關(guān)疾病的陽性血清反應(yīng),具有較高的特異性,進行臨床樣品檢測時,與牛分支桿菌分離培養(yǎng)的符合率為85.00%,與結(jié)核菌素皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)的符合率為79.73%,與韓國試紙條的符合率為98.75%。朱明東等[25]所建立的診斷布魯菌病的膠體金免疫層析法采用不同血清的用量確定敏感性及特異性,得出GICA的敏感性和特異性分別達到91.3%和97.3%,認為應(yīng)用GICA快速診斷牛布魯菌病具有敏感、特異、血清用量少、操作簡便等特點,更適合于布魯菌病的診斷、流行病學(xué)調(diào)查及現(xiàn)場應(yīng)用。高成秀等[26]建立了大腸埃希菌O 157和Stx2毒素的雙抗體夾心免疫膠體金層析法,可以同時檢測大腸埃希菌O 157抗原和Stx2毒素,可在較短時間內(nèi)檢測大腸埃希菌O 157并鑒定產(chǎn)Stx2的高致病性大腸埃希菌O 157,具有較高的特異性,在臨床中有較高的應(yīng)用價值。孫洋等[27]以腸出血性大腸埃希菌O 157單克隆抗體為標記探針,以兔抗O 157多克隆抗體固定于硝酸纖維素膜作為捕獲抗體,利用雙抗夾心法,制成O 157膠體金免疫層析檢測試紙條,該試紙條僅與O 157反應(yīng),與其他受試菌株均不反應(yīng),該試紙條敏感性高、特異性強、檢測速度快、操作簡便、可用于現(xiàn)場大量樣品的檢測。目前,國內(nèi)已經(jīng)有檢測動物布魯菌病抗體、動物布魯菌病抗原及豬鏈球菌2型抗原的免疫膠體金試紙條研制成功并申請了相關(guān)專利。

5 膠體金免疫層析技術(shù)在動物寄生蟲病檢測中的應(yīng)用

何偉等[28]建立了簡便、快速的膠體金試紙條檢測家畜血清中的抗血吸蟲抗體,檢測了33份陽性牛血清和50份陽性豬血清,陽性檢出率均為100%,檢測23份陰性牛血清和50份陰性豬血清,結(jié)果分別出現(xiàn)1份和3份陽性反應(yīng),陰性符合率分別為95.7%和94.0%,檢測感染肝片形吸蟲的牛和羊血清共計16份,有3份陽性,交叉反應(yīng)率為18.8%,表明該方法敏感性高,特異性較強。王艷華等[29]用建立的檢測弓形蟲抗體的免疫膠體金快速試紙條對動物弓形蟲病血清抗體進行檢測,并用弓形蟲IHA診斷方法進行對照試驗,結(jié)果表明,金標試紙的敏感度高于IHA,與弓形蟲IHA檢測結(jié)果的符合率為82.5%,且較弓形蟲IHA診斷試劑提前2 d檢測到抗體。張守發(fā)等[30]應(yīng)用膠體金免疫層析法與ELISA法檢測了現(xiàn)地的147份血清樣本,得出GICA相對于ELISA的陽性符合率為100%,陰性符合率為88.4%,總符合率為87.8%,認為GICA與ELISA法相比,具有敏感性高、特異性強、快速、準確、可單份操作、也可大批量檢測、結(jié)果易懂、無需儀器設(shè)備、操作人員無需進行技術(shù)培訓(xùn)等優(yōu)點,膠體金免疫層析法作為牛新孢子蟲病的一種血清學(xué)檢測方法有著良好的實用價值,適宜于基層獸醫(yī)單位的應(yīng)用。

6 膠體金免疫層析技術(shù)在水產(chǎn)動物疫病檢測中的應(yīng)用

隨著我國畜牧業(yè)的健康發(fā)展和對動物疫病檢側(cè)要求的提高,膠體金免疫層析技術(shù)(GICA)作為一種可靠的免疫學(xué)檢測技術(shù),特異性強、靈敏度高、簡便快速、無需特殊儀器設(shè)備,在動物病毒病、細菌病、寄生蟲病的檢疫工作中廣泛用于病原微生物的抗原、抗體檢測,大大提高了動物疫病的檢測效率。但GICA在水產(chǎn)動物疫病檢測中的應(yīng)用才剛剛起步。2006年,Wang X J等[31]建立了檢測蝦白斑綜合征病毒抗原的膠體金免疫層析試紙條,該方法的敏感性高于斑點免疫印跡測定試驗(dot-blot nitrocellulose enzyme immunoassay,DB-NC-EIA),因不需要儀器設(shè)備,必將成為蝦白斑綜合征病毒的快速檢測技術(shù)。國內(nèi),武漢大學(xué)的孟小林等發(fā)明了一種檢測對蝦白斑綜合征病毒的試紙條制備方法,并申請了專利[32]。

7 膠體金免疫層析技術(shù)的發(fā)展趨勢

膠體金免疫層析技術(shù)自誕生以來便以其簡便、快速、特異、敏感等優(yōu)點被廣泛應(yīng)用于快速檢測和現(xiàn)場診斷上,顯示出了巨大的發(fā)展?jié)摿蛷V闊的應(yīng)用前景。隨著膠體金標記對傳統(tǒng)三大標記物的替代,膠體金免疫層析技術(shù)(GICA)也有逐漸取代ELISA等檢測方法的趨勢。隨著該技術(shù)的臨床應(yīng)用,進一步提高膠體金免疫層析試驗的敏感性、特異性、實現(xiàn)多元檢測、實現(xiàn)定量或半定量檢測是未來膠體金免疫層析技術(shù)發(fā)展的方向。

7.1 進一步提高檢測靈敏度

靈敏度的提高無疑會拓寬膠體金免疫檢測技術(shù)的檢測范圍,以下二種方法將成為以后的研究方向:①提高膠體金質(zhì)量。進一步完善免疫膠體金的制備工藝,使之標準化、程序化,以利于提高檢測準確性和可重復(fù)性,從而減少假陰性(假陽性)結(jié)果的產(chǎn)生。②采用生物素-親和素系統(tǒng)以及免疫金銀染色法(IGSS)放大特異抗原抗體的反應(yīng)信號,增強金標記物的顯色效果,提高檢測靈敏度,無需特殊儀器設(shè)備的支持,將有效地拓寬膠體金免疫結(jié)合試驗的檢測范圍。

7.2 實現(xiàn)半定量或定量檢測

目前,免疫膠體金技術(shù)定量檢測有3種類型:第1種是通過試紙條的顏色深淺的視覺比較將結(jié)果分為陰性、弱陽性、中陽性和強陽性;第2種是將檢測線的反應(yīng)劑設(shè)計成只能結(jié)合已知一定量的分析物,任何過量的分析物將會和下一條檢測線結(jié)合,產(chǎn)生一個溫度計式的條帶梯度;第3種是應(yīng)用反射的光密度計測量顯色帶或斑點的顏色強度,將顏色強度轉(zhuǎn)化為數(shù)字指標。前兩種檢測方法雖簡便迅速,但只能提供半定量結(jié)果;第3種檢測方法雖能實現(xiàn)定量檢測,但需特殊的儀器,操作不便。新的、簡便實用的定量檢測技術(shù)的實現(xiàn)將使免疫膠體金技術(shù)在獸醫(yī)快速檢測上得到更為廣泛的應(yīng)用。

7.3 實現(xiàn)多元檢測

在同一膜上固定多種反應(yīng)物,即可作多種項目的測定,一次測定可以同時得到多組的測定結(jié)果,實現(xiàn)對多個指標的聯(lián)檢?？蛇M一步減少待檢時間,降低檢測成本,并集中得出數(shù)據(jù)。

7.4 通用試劑的應(yīng)用

研發(fā)多個檢測指標的通用試劑,如在間接法檢測中用膠體金標記葡萄球菌蛋白A代替標記抗動物IgG,用于各種抗體的檢測,有利于減少非特異性反應(yīng),穩(wěn)定檢測試劑的質(zhì)量。

8 結(jié)語

目前,獸醫(yī)臨床上許多病的診斷方法仍較多地局限于傳統(tǒng)的血清學(xué)診斷方法,難以適應(yīng)快速診斷的要求。近年來,膠體金免疫層析技術(shù)以其快速(僅需幾分鐘)、準確(特異性強、靈敏度高)、簡便(不需要昂貴儀器和專業(yè)人員)、肉眼判讀、實驗結(jié)果易保存等優(yōu)點,為動物疫病診斷技術(shù)提供了新的模式,是未來動物疫病診斷的一個發(fā)展方向。相信隨著新的標記物和制備方法的發(fā)展、標記技術(shù)的日趨成熟、單克隆抗體技術(shù)和分子生物學(xué)技術(shù)的廣泛應(yīng)用,膠體金免疫層析技術(shù)將會有更為廣闊的應(yīng)用前景,實現(xiàn)更加理想的價值,從而促進我國畜牧獸醫(yī)事業(yè)的健康、快速和持續(xù)發(fā)展。

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Application of Gold Immunochromatography Assay in Animal Disease

ZU Li-chuang1,WANG Jin-liang2,LI Jiao1,SHEN Zhi-qiang1,2

(1.Shandong Lvdu Bio-Sciences&Technology Co.Ltd.,Binzhou,Shandong,256600,China;2.Shandong Binzhou Animal Science&Veterinary Medicine Academy,Binzhou,Shandong,256600,China)

Gold immunochromatography assay technology is a new immunoassay technology developed on the basis of gold labeling technique,immunological diagnosis techniques and chromatography analysis techniques.This immunological diagnostic technique is widely used in animal disease diagnosis because of it's simple,rapid,non-polluting,without special equipment,specific,sensitive and intuitive to judge the results.Gold immunochromatography assay technology can be used for the diagnosis of viruses in animals,bacteria,parasites of aquatic animals,and will play an increasingly important role.In this paper,gold immunochromatography assay for diagnosis of animal diseases was reviewed.

gold immunochromatography assay;animal disease

S851.4

B

1007-5038(2010)08-0101-05

2010-01-25

祖立闖(1981-),男,黑龍江人,碩士,主要從事從事動物病毒學(xué)研究。*通訊作者