張宗舟,張 揚,陳志梅

（1.天水師范學院生命科學與化學學院,甘肅 天水 741001；2.蘭州交通大學化學與生物工程學院,甘肅蘭州 730070）

小隴山林區(qū)位于甘肅省東南部,屬長江、黃河上中游地區(qū),是兼有我國南北氣候特點的典型天然次生林區(qū),林地總面積83萬hm2,活立木總蓄積2.92×107m3,森林覆蓋率57.8%。加強小隴山林區(qū)森林資源的培育和管護,充分發(fā)揮森林資源的生態(tài)、經(jīng)濟和社會功能,對于建設(shè)長江、黃河上中游地區(qū)生態(tài)屏障具有深遠的意義,對當?shù)睾烷L江、黃河中下游地區(qū)的經(jīng)濟、社會發(fā)展及人民生命財產(chǎn)安全起到非常重要的作用,土壤微生物積極參與土壤物質(zhì)轉(zhuǎn)化過程,其在土壤形成、肥力演變、植物養(yǎng)分有效化、土壤結(jié)構(gòu)的形成與改良、有毒物質(zhì)降解及凈化等方面起著重要作用[1-3]。19世紀中葉,根瘤菌的分離鑒定標志著人類開始關(guān)注土壤微生物及其功能。至20世紀初葉,土壤微生物已經(jīng)發(fā)展成為一門獨立學科[4-6]。土壤微生物作為穩(wěn)定生態(tài)系統(tǒng),監(jiān)測土壤品質(zhì)變化的敏感指標,其多樣性研究在評價生態(tài)系統(tǒng)、維護生態(tài)平衡中發(fā)揮了重要作用,因此越來越多的學者將目光投向土壤微生物多樣性的研究和保護[7-11]。日本落葉松（Larix kaempferi）自1973年引入小隴山林區(qū)以來,由于早期速生,成林快,適應(yīng)性廣,已成為小隴山林業(yè)實驗局營造速生豐產(chǎn)林和天保工程公益林營造的主要樹種之一,并且在周邊地區(qū)得到了大面積的推廣和應(yīng)用[12]。目前林地對土壤微生物特征的影響有一些研究,但由于地域差異,不同林地種類和數(shù)量、組成不同,造成研究結(jié)果存在一定差別,其中同一林區(qū)不同林地種類對土壤微生物多樣性的研究更少[13-14]。本研究以甘肅小隴山林區(qū)日本落葉松林、華山松（Pinus armandi）林和混交林（華山松和落葉松混種）為對象來分析其土壤中的微生物多樣性,為科學有效地進行人工林的營造及大面積推廣、土壤的恢復(fù)與保育以及林地的發(fā)展提供科學依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 樣點概況及土樣采集小隴山林區(qū)（33°31′～34°41′N,104°23′～ 106°43′E）位于秦嶺的西部,海拔700～2 500 m,相對高差500～1 100 m,該區(qū)處于我國暖溫帶南緣與北亞熱帶的過渡地帶,氣候溫暖濕潤,大多數(shù)地域?qū)儆谂瘻貛?中溫帶半濕潤大陸性季風氣候類型,年平均氣溫7.1℃,極端最高氣溫39.2℃,極端最低氣溫-23.2℃；≥10℃積溫2 444～3 825℃·d；年降水量460～800 mm,降水集中分布于7～9月,一般春秋季降水占年降水量的70%～80%,降水的年際變化較大,枯、豐年降水量相差近一倍,年蒸發(fā)量989～1 658 mm,相對濕度68%～78%,年日照時數(shù)1 520～2 313 h,無霜期 120～218 d[15]。

土壤分布上,秦嶺以北為灰褐土,以南為黃褐土；其垂直分布比較明顯,北坡由低到高依次為碳酸鹽灰褐土、山地褐色土、山地淋溶褐色土、山地棕壤、山地暗棕壤、山地草甸棕壤、山地草甸土和亞高山草甸草原土。南坡由低到高依次為黃褐土、黃棕壤、山地棕壤和暗棕壤,土層厚30～60 cm,較濕潤,有機質(zhì)含量高,全氮、全鉀含量比較高,全磷含量相對較低,速效磷含量屬于中等水平[16],pH 值6.5～7.5,土壤質(zhì)地多屬壤土、輕壤土。研究區(qū)域有苔蘚、蕨類、裸子和被子植物224科945屬2 700多種。其中草本植物1 900多種,木本植物800多種（不包括引種栽培）,溫帶科屬占優(yōu)勢,熱帶、亞熱帶屬種比較少。木本植物以殼斗科、樺木科、松科、楊柳科、榆科、槭科、薔薇科和椴科等為主,構(gòu)成植被的主要組成成分。草本植物158科726屬,以禾本科、菊科、豆科、毛莨科、蘭科、唇形科和玄參科為主。

其自然植被兼有秦嶺南北區(qū)特點,屬溫帶暖溫帶落葉闊葉混交次生林,以櫟類及其他硬、軟闊葉樹種為主,有少量的落葉松（L.gmelinii）、馬尾松（P.massoniana）、油松（P.tabulaeformis）、云杉（Picea asperata）、白皮松（P.bungeana）等針葉樹種。林區(qū)的日本落葉松面積約1.87萬hm2[17]。

各土樣在采前首先用滅菌工具除去土壤表面的枯葉,鏟除表面1 cm左右的表土,以避免地面微生物與土樣混雜。然后采集 0～10 cm的土壤,每個取土區(qū)域在 3個點取土,并于預(yù)先準備好的塑料布上,剔除作物殘根,充分混合均勻后取適量土壤裝于無菌自封袋,帶回實驗室分析。

1.2 土壤微生物培養(yǎng)微生物采用稀釋平板培養(yǎng)法進行培養(yǎng)[18-19]。稀釋分離法為:稱取10 g土樣,加入盛有100 mL無菌水的250 mL三角燒瓶中,加入磁珠 3粒,在磁力攪拌器上震蕩10 min后,沉淀10 min,用無菌吸管吸取1 mL土壤懸浮液,注入到9 mL無菌水的試管中,制成10-2的土壤懸液,然后按 10倍法依次稀釋至 10-9。根據(jù)以下公式計算每克干土中的微生物數(shù)量:

霉菌用查氏（Czapek）培養(yǎng)基:葡萄糖30 g,NaNO32 g,K2HPO4·3H2O 1 g,KCl 0.5 g,MgSO4·7H2O 0.5 g,FeSO4·7H2O 0.01 g,瓊脂20 g,自來水1 000 mL,自然pH；放線菌用高氏1號培養(yǎng)基:可溶性淀粉20 g,KNO31 g,NaCl 0.5 g,K2HPO4·3H2O 0.5 g,MgSO4·7H2O 0.5 g,FeSO4·7H2O 0.01 g,瓊脂 20 g,自來水1 000 mL,pH值7.4～7.6；細菌用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基:牛肉膏3 g,蛋白胨 10 g,NaCl 5 g,瓊脂20 g,自來水1 000 mL,pH 值7.2～7.4；自生固氮菌用阿須貝（Ashby）培養(yǎng)基:甘露醇 10 g,KH2PO40.2 g,MgSO4·7H2O 0.2 g,NaCl 0.2 g,CaSO4·2H2O 0.1 g,CaCO35 g,自來水1 000 mL,瓊脂20 g,pH 值7.2～7.4。纖維素分解菌用無糖培養(yǎng)基:NH4NO35 g,MgSO4·7H2O 0.2 g,FeCl30.1 g,KH2PO45 g,自來水 1 000 mL,瓊脂20 g,自然pH值,滅菌后倒成平板,待凝固后,每皿在無菌條件下,放置一張中性濾紙；酵母菌用麥芽汁培養(yǎng)基:將干麥芽壓碎（不能太粗或太細,粗則影響糖化,細則阻礙過濾）[20-21]。取1份麥芽屑加4份水浸泡1 h,然后置于63℃水浴鍋中糖化6～12 h,用碘液滴檢至呈黃色至無色時表示糖化已完成,然后用4層紗布過濾。因濾液不澄清,用一雞蛋清充分打勻后倒入糖化液中,加熱攪拌至沸,過濾后即成為透明的麥芽汁,分裝后在121℃下滅菌20 min,備用。將制備的麥芽汁稀釋到5°～6°Be,pH 值 6.4。在其中加入 2.0%瓊脂后,經(jīng)滅菌即成為麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基。青霉菌屬、曲霉屬、交鏈孢屬、芽孢桿菌等均按照魏景超[22]、周與良和邢來君[23]方法進行鑒定和分類。

1.3 土壤微生物多樣性指數(shù)測定物種多樣性的研究方法和測定指數(shù)比較多,試驗根據(jù)土壤細菌、真菌、放線菌和各測定指數(shù)的特點及取樣數(shù)據(jù)的類型,選擇 Shannon-Wiener指數(shù)（H′）和Simpson指數(shù)（D）[24]:

式中,Pi是第i屬的多度比例,采用Pi=Ni/N計算；Ni是第i屬的菌株數(shù)；N=∑Ni,為全部屬的菌株數(shù)之和。H′和D2種多樣性指數(shù)在動植物群落研究中通常以種為測度單位,但在土壤微生物研究中,由于分離鑒定至種十分困難,因此把細菌、霉菌、放線菌、酵母菌以微生物群為研究單位套用 Shannon-Wiener指數(shù)和Simpson指數(shù),來研究土壤微生物的多樣性。用這樣的方法來預(yù)測土壤微生物多樣性是可行的[25-26]。

1.4 試驗方法每皿接種0.1 mL土壤稀釋液,涂布,倒置培養(yǎng)。細菌、放線菌28℃培養(yǎng)5 d,真菌25℃培養(yǎng)7 d,進行統(tǒng)計分析。細菌:用 10-7、10-8、10-9接種,各樣各稀釋度接種3皿,1皿對照。霉菌 :用 10-3、10-4、10-5接種 ,各樣各稀釋度接種 3皿,1皿對照。放線菌:用 10-4、10-5、10-6接種,各樣各稀釋度接種3皿,1皿對照。酵母菌 :用 10-4、10-5、10-6接種,各樣各稀釋度接種3皿,1皿對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 幾種松樹林土壤微生物區(qū)系土壤微生物是土壤肥力的重要指標,它的變化除了受土壤理化指標的影響外,還要受地上植物的影響。林木種類不同,根系代謝產(chǎn)物則不同,將會對土壤中的微生物帶來直接的影響。華山松林、混交林、落葉松林的微生物區(qū)系測定結(jié)果如表1。

表1 不同林地土壤微生物區(qū)系分析 個/（g）

落葉松林土壤中霉菌的數(shù)量較高,是華山松林土壤中的1.86倍,而細菌數(shù)量僅為華山松林的18.6%,放線菌數(shù)量僅為18.4%,酵母菌數(shù)量僅為15%?；旖涣值奈⑸锓N類與數(shù)量分布狀態(tài)都處于華山松﹑落葉松之間,這可能與落葉松每年的落葉為土壤提供了大量纖維素等大分子物質(zhì)誘導(dǎo)土壤霉菌數(shù)量的增加有關(guān)。這些落葉松的根系分泌物不利于細菌、放線菌、酵母菌的生長,加之大量的松針并不是細菌、放線菌、酵母菌的良好碳源。在細菌數(shù)量中纖維素分解菌,因能分解纖維素,其數(shù)量在華山松土壤細菌中占5.8%,而在落葉松土壤細菌中占25%。這種現(xiàn)象符合上述推斷。自生固氮菌在華山松土壤細菌中占7.6%,在落葉松土壤細菌中占3.1%。說明落葉松、華山松的根系對自生固氮菌的影響不明顯,在落葉松土壤中略受影響。霉菌中的交鏈孢霉屬在華山松土壤霉菌中占15.9%,而在落葉松土壤霉菌中僅占2.6%,可能落葉松的生長直接制約了交鏈孢霉的生長,曲霉屬在華山松土壤中占霉菌總數(shù)的12.7%,在落葉松土壤中占霉菌總數(shù)的15.4%；青霉菌屬在華山松土壤中占霉菌總數(shù)的50.8%,在落葉松土壤中占霉菌總數(shù)的58.1%,說明落葉松曲霉屬﹑青霉菌屬的生長沒有受到抑制作用,所占比例變化不明顯（表2）。

2.2 土壤微生物多樣性分析按照Simpson指數(shù)和Shannon-Wiener指數(shù)分析,將基本數(shù)據(jù)整理后列于表3中。在霉菌生物多樣性方面華山松林下的土壤最好,混交林下土壤次之,落葉松林下土壤最差。這個結(jié)果與表1的結(jié)果是吻合的,也與表1的分析相互印證。在細菌多樣性分析結(jié)果中可以看出,落葉松土壤中細菌最好,華山松土壤中細菌均勻度次之,混交林土壤接近華山松。說明混交林、華山松和落葉松根系代謝產(chǎn)物對細菌影響不大。以上數(shù)據(jù)說明落葉松由于每年產(chǎn)生大量的松針,以及根系代謝產(chǎn)物對霉菌多樣性有促進作用。落葉松的松針以及根系產(chǎn)生的氣味可能對細菌的生長產(chǎn)生抑制作用。

表2 不同林地土壤微生物比例%

表3 不同林地土壤微生物區(qū)系多樣性分析

3 討論

不同林木品種會對土壤中微生物區(qū)系帶來較大影響,林木的落葉以及根系代謝產(chǎn)物直接影響土壤中微生物的種類與數(shù)量。以往研究表明,日本落葉松的引種在一定程度上造成了土壤理化性質(zhì)的改變,也對該地區(qū)的土壤細菌多樣性產(chǎn)生了一定影響,使其群落組成明顯區(qū)別于其他林型[27]。本研究從微生物豐富度來分析,結(jié)果表明,落葉松林土壤中霉菌的數(shù)量較高,是華山松林土壤中的1.86倍,而細菌數(shù)量僅為華山松林的18.6%,放線菌數(shù)量僅為18.4%,酵母菌數(shù)量僅為15%。

土壤中的微生物以其豐富的生物多樣性使它們成為生態(tài)系統(tǒng)中最活躍和具有決定性影響的組分之一。已有研究表明,土壤微生物通過相互競爭、協(xié)調(diào)、驅(qū)動養(yǎng)分循環(huán)等作用影響著植物多樣性[28-29]。本研究表明,日本落葉松對土壤細菌的生長影響較大,細菌數(shù)量減少,但對細菌的均勻度影響不大。華山松的霉菌類群的均勻度比混交林中的差,比落葉松中的更差。日本落葉松可以促進土壤中霉菌數(shù)量增加,但抑制細菌、放線菌和酵母菌的生長,使細菌、放線菌和酵母菌的數(shù)量減少,影響土壤微生物的豐富度。

天水小隴山林區(qū)通過引進外來樹種日本落葉松提高了林區(qū)的保護及林木生產(chǎn)功能,但日本落葉松的引進會對當?shù)赝寥拉h(huán)境產(chǎn)生一定影響,本研究僅從土壤細菌群落的多樣性方面進行了初步的探討和分析,是否能導(dǎo)致當?shù)赝寥郎鷳B(tài)系統(tǒng)的改變以及改變的機制,還有待于從其他方面進一步加以深入研究。

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