廖海艷，王方劍，薛立群

（1.湖南第一師范學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410205；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410205）

胚胎附植是指胚泡與子宮內(nèi)膜粘附并植入子宮內(nèi)膜基質(zhì)、形成胎盤的過程，成功的植入不僅取決于胚泡滋養(yǎng)層細(xì)胞對(duì)母體子宮的侵入性，而且取決于子宮對(duì)胚泡的相容性和營養(yǎng)供應(yīng)。前者涉及細(xì)胞的黏附、遷移、ECM的降解等，后者涉及蛋白酶對(duì)子宮內(nèi)膜的組織降解、更新以及血管新生。而NO（一氧化氮）是調(diào)節(jié)血管功能和炎癥反應(yīng),介導(dǎo)組織重建和細(xì)胞凋亡,影響胚胎發(fā)育和附植多種生理過程的一個(gè)重要的旁分泌調(diào)節(jié)因子[1]。生理狀況下，NO、ECM、MMPs、TIMPs（基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑）、細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞等諸多因素之間，存在著復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)控制機(jī)制，以適應(yīng)機(jī)體組織正常的胚胎發(fā)生和附植、器官形成、組織塑型、創(chuàng)傷修復(fù)和動(dòng)態(tài)平衡的需要[2－3]。本試驗(yàn)是用子宮角注射的方法，在小鼠胚胎附植期子宮角注射NOS的非特異性抑制劑N-硝基L-精氨酸甲酯（L-NAME）或L-NAME+SNP（硝普鈉）來研究一氧化氮（NO）在胚胎植入過程中可能發(fā)揮的作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為BABL系小白鼠，購自湖南中醫(yī)學(xué)院小動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，50日齡,體重20 g左右。實(shí)驗(yàn)鼠在自然光照條件下采用自由采食和飲水的方式飼養(yǎng)。

1.1.2 試劑L-NAME和SNP均由美國Sigma公司提供。L-NAME和SNP的配制:分別稱取適量的L-NAME和SNP，溶于無菌的9 g/L氯化鈉溶液中。

1.2 方法

1.2.1 子宮角注射將雌性、雄性小鼠按2∶l比例合籠，次晨查出陰栓者定為妊娠第l天（D1）。雌鼠于D3下午麻醉后，左側(cè)子宮角內(nèi)注藥，右側(cè)子宮角內(nèi)注入等體積（4 pL）生理鹽水作為對(duì)照。

1.2.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)分為3組，每組處理小鼠8～l0只。處理1:于附植早期/中期/后期分別處理8～10只；于D2/D4/D6下午麻醉后，注射L-NAME 0.2 mg/只。受試動(dòng)物分別于注藥后2 d（D4/D6/D8）剖檢，觀察并計(jì)數(shù)兩側(cè)子宮角植入胚胎數(shù),并收集雙側(cè)子宮,直接存放于－80℃以制作組織切片。處理2:6～8只雌鼠，D2下午麻醉后，注射L-NAME 0.2 mg+SNP 10μg/只，注藥后6 d（D8）剖檢，觀察并計(jì)數(shù)兩側(cè)子宮角植入胚胎數(shù),并收集雙側(cè)子宮,直接存放于－80℃以制作組織切片。處理3（胚胎發(fā)育觀察組）:6～8只雌鼠，D2下午麻醉后，注射LNAME 0.2 mg/只。注藥后6 d（D8）剖檢，觀察并計(jì)數(shù)兩側(cè)子宮角植入胚胎數(shù),并收集雙側(cè)子宮,直接存放于－80℃以制作組織切片。

1.2.3 子宮組織切片和形態(tài)學(xué)觀察子宮組織切片的制作是用經(jīng)10%中性福爾馬林液固定好的子宮組織樣品進(jìn)行修整，使之符合石蠟組織切片要求，然后進(jìn)行脫水、透明、浸蠟和石蠟包埋；進(jìn)行連續(xù)切片，分段取樣鋪片，切片厚度為5μm，對(duì)鋪好的玻片放入烘箱，58℃過夜烤片；進(jìn)行HE（haematoxylin eosin）染色:對(duì)烤好的切片進(jìn)行脫蠟、脫二甲苯、蘇木素染色、鹽酸酒精分化、蘭化、伊紅復(fù)染和封片，42℃烘片12 h，用組織切片盒保存?zhèn)溆?。在生物顯微鏡或倒置顯微鏡下對(duì)切片進(jìn)行觀察，對(duì)特征性圖像進(jìn)行顯微照相。

2 結(jié)果與分析

2.1 NO對(duì)小鼠胚胎植入數(shù)的影響結(jié)果

如圖1至圖4所示，小鼠子宮角注射NOS抑制劑L-NAME后,胚胎植入數(shù)出現(xiàn)下降，當(dāng)L-NAME和SNP合并注射時(shí)則使胚胎植入數(shù)恢復(fù)到正常水平，這說明NO參與了胚胎植入過程的調(diào)節(jié)。

圖1顯示L-NAME 0.2 mg/只處理后,在胚胎附植前期（D4）、附植期（D6）、附植后期（D8）的兩側(cè)子宮角胚胎植入數(shù)的變化。由圖可知,子宮角注射LNAME后,子宮角的胚胎植入數(shù)受到顯著抑制。

圖1 子宮角注射NOS抑制劑對(duì)小鼠胚胎植入的影響

圖2顯示妊娠小鼠于D8子宮角注射LNAME或L-NAME和SNP合并注射對(duì)小鼠胚胎植入的影響。從此圖中可以看出,與對(duì)照側(cè)相比,L-NAME 0.2 mg/只處理組小鼠子宮角的胚胎植入數(shù)顯著降低,當(dāng)L-NAME和SNP（一種NO的自發(fā)性供體）合并注射時(shí),對(duì)小鼠的胚胎植入數(shù)沒有多大影響。

圖2 D8注入NO抑制劑和D8注入NO抑制劑+SNP對(duì)小鼠胚胎植入的影響

圖3顯示經(jīng)左側(cè)子宮角注射L-NAME，右側(cè)子宮角注射生理鹽水處理后于D8時(shí)子宮的發(fā)育情況。通過圖片可以看出，與對(duì)照側(cè)相比,L-NAME處理側(cè)小鼠子宮角的胚胎植入數(shù)為0個(gè)，而對(duì)照側(cè)為4個(gè)胚胎數(shù)。由此可見，L-NAME處理側(cè)小鼠子宮角的胚胎植入數(shù)顯著降低。

圖4顯示經(jīng)左側(cè)子宮角進(jìn)行L-NAME和SNP合并注射，而右側(cè)子宮角注射生理鹽水處理后在D8時(shí)子宮的發(fā)育情況。通過圖片可以看出，與對(duì)照側(cè)相比,L-NAME和SNP合并注射處理側(cè)小鼠子宮角的胚胎植入數(shù)為3個(gè)，而對(duì)照側(cè)為4個(gè)胚胎數(shù)。由此可見，當(dāng)L-NAME和SNP合并注射時(shí),對(duì)小鼠的胚胎植入數(shù)沒有多大影響。

圖3 左側(cè)子宮角注射LNAME后于D8時(shí)子宮發(fā)育情況

圖4 左側(cè)子宮角進(jìn)行LNAME和SNP合并注射后于D8時(shí)子宮發(fā)育情況圖

2.2 子宮內(nèi)膜組織形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

為了更進(jìn)一步了解NO對(duì)小鼠胚胎植入的影響，對(duì)所收集的子宮均進(jìn)行了組織切片和組織形態(tài)學(xué)觀察。通過組織形態(tài)學(xué)觀察可以發(fā)現(xiàn):在小鼠胚胎附植過程中，NO對(duì)子宮內(nèi)膜的發(fā)育有影響。影響表現(xiàn)為對(duì)血管的通透性、厚度的變化的影響以及對(duì)蛻膜細(xì)胞的形成有作用。而子宮內(nèi)膜的這些結(jié)構(gòu)在胚胎附植的不同時(shí)期所表現(xiàn)出的變化特征均有所不同。

在附植前期，通過形態(tài)學(xué)觀察顯示，妊娠對(duì)照側(cè)和抑制側(cè)的子宮內(nèi)膜均有一定程度發(fā)育,即柱狀上皮細(xì)胞開始增高、變大，腺體數(shù)目也都開始增多。但妊娠對(duì)照側(cè)子宮內(nèi)膜的發(fā)育比較明顯，尤其是柱狀上皮細(xì)胞增高比較明顯（見圖5）。

圖5 附植前期子宮切片圖（100×；左圖為對(duì)照側(cè)子宮，右圖為抑制側(cè)子宮）

在附植期，通過在400×顯微鏡下仔細(xì)觀察可發(fā)現(xiàn)，妊娠對(duì)照側(cè)的子宮內(nèi)膜進(jìn)一步發(fā)育，單層柱狀上皮細(xì)胞增高更加明顯，腺體數(shù)目明顯增多,羽狀突起非常明顯；抑制側(cè)子宮內(nèi)膜柱狀上皮細(xì)胞相對(duì)高度較低，腺體數(shù)少，羽狀突起較少。對(duì)照側(cè)螺旋動(dòng)脈豐富且擴(kuò)張，通透性增強(qiáng)，基質(zhì)細(xì)胞形成蛻膜細(xì)胞，發(fā)生明顯的蛻膜樣變，基質(zhì)變得疏松，同時(shí)子宮內(nèi)膜腺呈現(xiàn)出明顯的活動(dòng)狀態(tài);而抑制側(cè)子宮內(nèi)膜基質(zhì)則相對(duì)致密，螺旋動(dòng)脈的分布也不是很明顯（見圖6）。

圖6 附植期子宮切片圖（400×；左圖為對(duì)照側(cè)、右圖為抑制側(cè)）

3 討論

本研究采用子宮角注射法研究了NO對(duì)小鼠胚胎植入的影響，以探討NO在胚胎植入中的作用機(jī)理。子宮角注射法所使用的藥物劑量小，可以顯示出藥物對(duì)胚胎植入的直接影響和局部作用[4]。通過子宮角注射L-NAME后，子宮中NO的產(chǎn)生確實(shí)受到了抑制。SNP是一種NO釋放劑，它可自發(fā)釋放NO，當(dāng)在L-NAME中加入SNP后再對(duì)小鼠進(jìn)行子宮角注射，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，處理側(cè)的胚胎植入數(shù)沒有明顯的變化。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，NO在小鼠胚胎植入過程中起重要作用。這個(gè)作用具體通過什么來實(shí)現(xiàn)，還有待于進(jìn)一步研究。沈政等[5]采用小鼠胚泡體外植入模型，利用NOS抑制劑L-單甲基-精氨酸、NO供體s-亞硝基-乙酰青霉胺8-BrcGMP對(duì)胚泡黏附擴(kuò)展以及MMP-2分泌的影響進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)NO能促進(jìn)體外小鼠胚泡的黏附、擴(kuò)展及MMP-2的分泌，提示NO的這些作用可能是通過cGMP來實(shí)現(xiàn)的。

子宮血管通透性的增強(qiáng)是著床的一個(gè)標(biāo)志，子宮充足的血液供給對(duì)于胚胎著床是十分必要的。在血管中，NO由eNOS催化合成，是有效的血管擴(kuò)張和血小板抑制因子。eNOS在分泌期子宮內(nèi)膜腺上皮和微血管內(nèi)皮中表達(dá)[6]。iNOS在人月經(jīng)周期的分泌晚期和月經(jīng)開始時(shí)的子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞、免疫活性細(xì)胞和蛻膜基質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，高濃度時(shí)可合成NO，并且具有前炎癥反應(yīng)的特點(diǎn)，是支持和維持蛻膜過程必需的因子。eNOS和iNOS在著床期發(fā)生上調(diào)[7]。另外，eNOS在著床位點(diǎn)錨定的絨毛細(xì)胞和滋養(yǎng)層細(xì)胞中的表達(dá)顯著升高，在合體滋養(yǎng)層也有表達(dá)，說明eNOS對(duì)著床和血管侵入過程也起一定的作用。本試驗(yàn)通過抑制附植期NO的形成，使得子宮平滑肌明顯緊縮、子宮血管的通透性也顯著降低，提示NO可能通過對(duì)血管的通透性的調(diào)節(jié)來影響子宮內(nèi)膜的脫膜化過程。

胚胎植入受一系列復(fù)雜因素的嚴(yán)格調(diào)控，胚胎成功植入需要各種因子之間的協(xié)調(diào)作用。胚胎植入過程中一個(gè)最突出的現(xiàn)象是子宮內(nèi)膜ECM成分的重組和更新。研究表明，MMPs是胚胎植入過程中降解ECM的主要酶，其蛋白表達(dá)與胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞的最大侵入能力相吻合，是構(gòu)成胚胎侵入能力的主要因素[8]。丁雋等[9]應(yīng)用基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑（l，l0一菲羅啉）作用于妊娠大鼠造成流產(chǎn)的模型，以驗(yàn)證基質(zhì)金屬蛋白酶在正常妊娠中的作用時(shí)發(fā)現(xiàn)，基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑在妊娠期抑制MMPs的表達(dá)，使MMPs的分泌不足，導(dǎo)致流產(chǎn)或胎鼠宮內(nèi)生長(zhǎng)遲緩，說明了MMPs在胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤(rùn)和妊娠的維持中具有重要作用。目前，對(duì)于NO調(diào)節(jié)子宮MMP-9基因轉(zhuǎn)錄水平的分子機(jī)制尚不清楚，這還有待于進(jìn)一步研究。

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