劉代，魏岳榮，胡家金

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128;2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所，廣東 廣州 510640）

到目前為止，只有3篇關(guān)于通過(guò)體細(xì)胞雜交成功獲得香蕉雜種植株的報(bào)道[1-3]。本研究以在我國(guó)廣泛種植的香蕉栽培品種“過(guò)山香”（Musa AAB Silk cv.Guoshanxiang）和具有抗病、抗寒基因的野生阿寬蕉（Musa itinerans Cheesm.AB Group）為材料，探索香蕉電融合的技術(shù)參數(shù)，旨在通過(guò)體細(xì)胞雜交為香蕉栽培品種轉(zhuǎn)入抗病、抗寒基因，從而達(dá)到改善香蕉品質(zhì)的目的，為香蕉的體細(xì)胞雜交和品種改良提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料香蕉品種“過(guò)山香”和野生阿寬蕉。

1.1.2 培養(yǎng)基與酶液（1）懸浮培養(yǎng)基為M2培養(yǎng)基:MS鹽+100 mg/L麥芽提取物+100 mg/L谷氨酰胺＋100 mg/L肌醇+1 mg/L生物素＋1 mg/L 2,4-D+45 g/L蔗糖，pH 5.3。（2）看護(hù)培養(yǎng)基:MS鹽+Morel and Wetmore維生素＋2 mg/L 2，4-D+250 mg/L葡萄糖＋72 g/L麥芽糖＋20 g/L蔗糖＋2 mL/L椰乳，pH 5.7，過(guò)濾滅菌。（3）野生阿寬蕉原生質(zhì)體的分離酶液:3.0%纖維素酶（Cellulase，Onozuka R-10，Yakult）+0.2%果膠酶（pectinase，Yakult）+1%離析酶（Macerozyme，R-10，Yakult）。（4）分離“過(guò)山香”原生質(zhì)體的酶液:3.5%纖維素酶（Cellulase，Onozuka R-10，Yakult）+0.15%果膠酶（pectinase，Yakult）+1%離析酶（Macerozyme，R-10，Yakult）+15.2 g/L KCl+7.8 g/L CaCl2+11%甘露醇+100 mg/L MES。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 野生阿寬蕉原生質(zhì)體的分離野生阿寬蕉ECS參考魏岳榮方法通過(guò)種子途徑建立，初始接種量為1.5%，每隔15 d繼代1次，培養(yǎng)溫度27℃，懸浮暗培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速110 r/min。

取懸浮培養(yǎng)繼代后7 d的ECS經(jīng)200μm的細(xì)胞篩過(guò)濾后，取0.5 mL PCV的ECS加入到10 mL酶液中進(jìn)行酶解。酶采用酶溶解液（15.2 g/L KCl、7.8 g/L CaCl2、11%甘露醇、100 mg/L MES）進(jìn)行溶解，pH 5.7，經(jīng)直徑0.22μm微孔濾膜過(guò)濾滅菌。在50 r/min的搖床上，27℃，黑暗條件下酶解8 h。采用過(guò)濾離心法進(jìn)行原生質(zhì)體的洗滌和純化，純化后的原生質(zhì)體，最后用電融合液洗滌2次，電融合液的組成為:11%甘露醇+0.1 mmol/L CaCl2，然后將原生質(zhì)體用電融合液調(diào)整密度為105個(gè)/mL備用。

1.2.2 “過(guò)山香”原生質(zhì)體的分離“過(guò)山香”香蕉的胚性細(xì)胞懸浮系（ECS）由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所通過(guò)多芽體途徑建立[4]，參照肖望等的方法[5]分離“過(guò)山香”原生質(zhì)體。純化后的原生質(zhì)體用電融合液洗滌2次，最后將原生質(zhì)體用電融合液將密度調(diào)至105個(gè)/mL備用。

1.2.3 原生質(zhì)體的融合將處理后的親本原生質(zhì)體按1∶1體積混合，取250μL原生質(zhì)體混合液體小心地加入到電融合儀融合小室的底部，電融合儀為“Multiporator 4308（Eppendorf公司）”，融合室為250μL螺旋型鉑金電極，電極間距為0.2 mm。將鉑金電極小心地插入融合室中，緩慢旋緊使融合室不產(chǎn)生氣泡，然后連接到共軸連接頭上，靜置10 min，選擇設(shè)計(jì)融合參數(shù)，室溫下進(jìn)行電融合實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 電融合參數(shù)的選擇利用電融合儀平行單電極微型融合池（電極間距0.2 mm）進(jìn)行“過(guò)山香”和野生阿寬蕉原生質(zhì)體電融合參數(shù)的選擇。將50 μL原生質(zhì)體混合液均勻地加入到微型融合池中，在倒置顯微鏡下靜置10 min后，觀察原生質(zhì)體成串情況，改變電極間的交流電場(chǎng)和電擊時(shí)間使得大多數(shù)細(xì)胞成串為2～3個(gè)，施加直流脈沖電壓，優(yōu)化融合參數(shù)，使融合率和原生質(zhì)體活力達(dá)到最佳值。在倒置顯微鏡下統(tǒng)計(jì)融合率，用熒光素雙醋酸酯（FDA）染色法進(jìn)行原生質(zhì)體活力檢測(cè)。每個(gè)數(shù)據(jù)為5個(gè)視野的平均數(shù)，重復(fù)3次。融合率按以下公式計(jì)算:

1.2.5 融合產(chǎn)物的培養(yǎng)融合完畢后，靜置20 min，將原生質(zhì)體懸浮液從融合室內(nèi)用移液體槍小心吸出置于1.5 mL離心管中，在800 r/min轉(zhuǎn)速下離心5 min后去掉上清液，再添加1 mL原生質(zhì)體培養(yǎng)基，在800 r/min轉(zhuǎn)速下離心5 min，去掉上清液。最后用原生質(zhì)體培養(yǎng)基調(diào)整原生質(zhì)體密度為5×105個(gè)/mL。參考肖望等的方法[10]取其1 mL加入到看護(hù)培養(yǎng)基中，27℃，暗培養(yǎng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 交流電場(chǎng)強(qiáng)度對(duì)原生質(zhì)體串珠形成的影響

交流電壓（AC）的強(qiáng)度以及作用時(shí)間直接影響到原生質(zhì)體融合時(shí)的成串效果。將雙親原生質(zhì)體按1∶1的比例混合后加入融合室中后，靜置10 min，待大多數(shù)細(xì)胞沉降下來(lái)，使融合細(xì)胞處于同一層次，從而避免原生質(zhì)體處于空間不同位置而不能成串。施加交變電壓，細(xì)胞的成串效果是由AC強(qiáng)度及其作用時(shí)間共同決定的，AC強(qiáng)度過(guò)小、作用時(shí)間過(guò)短，使細(xì)胞不能緊密相鄰，難以達(dá)到融合；AC強(qiáng)度過(guò)大和時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，一方面對(duì)細(xì)胞造成傷害，另一方面易形成多細(xì)胞融臺(tái)體。表1結(jié)果顯示:在電極距為0.2 mm的條件下，當(dāng)AC增加到100 V時(shí)，原生質(zhì)體開始有轉(zhuǎn)動(dòng)現(xiàn)象，但細(xì)胞很少有成串排列現(xiàn)象；當(dāng)AC增加至150 V時(shí)，原生質(zhì)體開始移動(dòng)，并且沿電場(chǎng)方向形成平行排列的串珠；當(dāng)AC增加至200 V時(shí)，串珠長(zhǎng)度大約為2～3個(gè)/串；AC強(qiáng)度繼續(xù)增加，則形成串珠的時(shí)間縮短，且串珠長(zhǎng)度增加，原生質(zhì)體開始有變形現(xiàn)象；此時(shí)繼續(xù)加大AC強(qiáng)度，一部分原生質(zhì)體被拉得很長(zhǎng)而破裂。由此可見，調(diào)整AC強(qiáng)度和時(shí)間對(duì)提高香蕉原生質(zhì)體理想細(xì)胞串有明顯效果。試驗(yàn)表明，AC作用強(qiáng)度200 V/cm、作用時(shí)間30 s為香蕉原生質(zhì)體融合的適宜交流電場(chǎng)強(qiáng)度。

表1 交流電場(chǎng)對(duì)原生質(zhì)體串珠形成的影響

2.2 直流脈沖強(qiáng)度對(duì)原生質(zhì)體融合的影響

直流脈沖（DC）強(qiáng)度是影響原生質(zhì)體融合效率的一個(gè)重要因素。當(dāng)大多數(shù)細(xì)胞成為2～3個(gè)串珠時(shí)，施加瞬時(shí)DC脈沖電壓，細(xì)胞開始融合，施加的脈沖電壓以細(xì)胞串振動(dòng)和串珠剛剛斷裂為標(biāo)準(zhǔn)，靜置約20 min后融合體成為圓球體。表2結(jié)果顯示直流脈沖強(qiáng)度對(duì)融合效率的影響，當(dāng)DC強(qiáng)度為500 V/cm時(shí)，未能觀察到原生質(zhì)體融合；隨著DC強(qiáng)度的增加，原生質(zhì)體融合率逐漸升高，但細(xì)胞活力下降；當(dāng)DC強(qiáng)度為1500 V/cm時(shí)，融合率達(dá)到最高，為32.4%；隨著DC強(qiáng)度的繼續(xù)加大，原生質(zhì)體融合頻率下降，部分串珠解體和部分原生質(zhì)體破裂，還有部分原生質(zhì)體失活，從而影響以后的培養(yǎng)效果。因此，確定DC強(qiáng)度1500 V/cm為香蕉原生質(zhì)體融合的適宜脈沖強(qiáng)度。

表2 不同直流脈沖強(qiáng)度對(duì)融合率的影響

2.3 直流脈沖作用時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體融合的影響

在AC為200 V/cm，AC作用時(shí)間30 s，DC強(qiáng)度為1500 V/cm的條件下，研究了不同DC作用時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體融合率的影響，試驗(yàn)結(jié)果見表3。當(dāng)DC作用時(shí)間為10μs時(shí)，沒(méi)有融合的發(fā)生；當(dāng)DC作用時(shí)間為40μs時(shí)，融合率達(dá)到32.7%，活力80.5%；當(dāng)DC作用時(shí)間為50μs時(shí)，融合率達(dá)到最高，為34.9%，但此時(shí)原生質(zhì)體活力下降到76.1%；DC作用時(shí)間為60μs時(shí)，融合率和原生質(zhì)體的活力均下降。據(jù)此，確定最佳DC作用時(shí)間為50μs。

表3 不同直流脈沖作用時(shí)間對(duì)融合頻率的影響

2.4 直流脈沖作用次數(shù)對(duì)原生質(zhì)體融合的影響

在AC為200 V/cm，AC作用時(shí)間30 s，DC強(qiáng)度為1500 V/cm，DC作用時(shí)間為40μs的條件下，研究了不同DC作用次數(shù)對(duì)原生質(zhì)體融合率的影響。從試驗(yàn)結(jié)果（表4）看出:脈沖次數(shù)對(duì)原生質(zhì)體融合率和細(xì)胞活力具有一定的影響，當(dāng)脈沖次數(shù)為1次時(shí)，融合率較低；脈沖次數(shù)為2次時(shí)，原生質(zhì)體融合率和原生質(zhì)體活力達(dá)到最大，分別為32.4%和81.4%；脈沖次數(shù)超過(guò)3次時(shí)，部分原生質(zhì)體開始破裂，原生質(zhì)體活力下降。因此，確定脈沖次數(shù)2次為理想脈沖次數(shù)。

表4 脈沖次數(shù)對(duì)原生質(zhì)體融合率的影響

3 討論與結(jié)論

細(xì)胞融合技術(shù)在植物育種上具有很大的意義，它既能克服種間雜交的不親和性，又能在親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的植物之間轉(zhuǎn)移染色體及細(xì)胞質(zhì)，從而創(chuàng)造出新物種。電融合是通過(guò)適當(dāng)強(qiáng)度的電脈沖處理使原生質(zhì)體質(zhì)膜發(fā)生可逆擊穿而融合。它與PEG介導(dǎo)融合法相比，具有對(duì)細(xì)胞傷害小、易于觀察等特點(diǎn)。雖然電融合原理已經(jīng)清楚，但在實(shí)際操作中理想?yún)?shù)的確定受材料、融合儀及融合室類型的影響。如交變場(chǎng)強(qiáng)過(guò)大或脈沖強(qiáng)度過(guò)強(qiáng)均會(huì)造成原生質(zhì)體破損，但若交變場(chǎng)強(qiáng)強(qiáng)度過(guò)小或脈沖強(qiáng)度不夠，則融合效果不佳。在香蕉原生質(zhì)體電融合過(guò)程中觀測(cè)到不同層次上的原生質(zhì)體在同一交流電場(chǎng)上的作用下的運(yùn)動(dòng)速度不同，成串時(shí)間也不同，并且不同層次上的原生質(zhì)體由于空間位置關(guān)系不容易粘連。本試驗(yàn)將原生質(zhì)體混合液靜置10 min后，使原生質(zhì)體全處于同一層次上再進(jìn)行電融合參數(shù)的選擇，從而確立最佳的電融合參數(shù)。本試驗(yàn)建立適合香蕉原生質(zhì)體體細(xì)胞雜交的電融合參數(shù)體系是:在電融合液為11%甘露醇+0.1 mmol/L CaCl2的條件下，AC強(qiáng)度為200 V/cm，作用時(shí)間30 s時(shí)，原生質(zhì)體兩兩緊密接觸，成對(duì)效果好；對(duì)直流脈沖的研究發(fā)現(xiàn)，DC強(qiáng)度為1500 V/cm，作用時(shí)間40μs，脈沖次數(shù)2次時(shí)，原生質(zhì)體融合的效率和活力達(dá)到最高值，分別為32.4%和81.4%。這一結(jié)果為香蕉體細(xì)胞雜交及再生培養(yǎng)研究提供了技術(shù)參考。

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[4]魏岳榮，黃學(xué)林，黃霞，等.香蕉多芽體的誘導(dǎo)及其體細(xì)胞胚發(fā)生[J].園藝學(xué)報(bào)，2005，32:414-419.

[5]肖望，黃霞，魏岳榮.“過(guò)山香”香蕉原生質(zhì)體培養(yǎng)及植株再生[J].園藝學(xué)報(bào)，2008，35（6）:873-878.