周艷明，忻 雪

(沈陽農(nóng)業(yè)大學分析測試中心，遼寧 沈陽 110866)

高效液相色譜法測定果蔬中7種植物激素的殘留量

周艷明，忻 雪

(沈陽農(nóng)業(yè)大學分析測試中心，遼寧 沈陽 110866)

建立高效液相色譜法測定果蔬中7種植物激素殘留的方法。選擇10種果蔬樣品，經(jīng)體積分數(shù)80%甲醇提取后、過C18柱凈化，用帶有紫外檢測器的液相色譜儀測定，外標法定量。通過對該方法的精密度和加標回收實驗，所有激素的添加回收率均在70.23%～98.10%之間，回收率的變異系數(shù)在3.34%～10.12%之間，方法的最低檢出限為0.004～0.02mg/kg、最低定量限為0.01～0.1mg/kg，所建立的果蔬中植物激素殘留量的測定方法滿足國家標準對食品中農(nóng)藥殘留測定的要求，可提供給相關(guān)部門用于對相關(guān)農(nóng)產(chǎn)品、食品的質(zhì)量監(jiān)控。

高效液相色譜法；果蔬；植物激素

植物激素是植物體內(nèi)合成的對植物生長發(fā)育有顯著作用的集中微量有機物質(zhì)，其生理效應非常復雜、多樣。植物激素影響細胞的分裂、伸長、分化及植物發(fā)芽、生根、開花、結(jié)實、性別的決定、休眠和脫落等[1-2]，所以植物激素對植物的生長發(fā)育有重要調(diào)節(jié)控制作用。

在進行高效液相色譜法測定時選擇合適的植物激素提取純化方法和色譜條件極為重要。如果提取純化方法不當，樣品中含有的雜質(zhì)較多，將難以對目的組分進行有效分離，不能達到檢測目的[3-4]；如果沒有合適的色譜條件，測定時會出現(xiàn)分離差、峰型不良及嚴重拖尾現(xiàn)象。目前，大多液相色譜法只能同時測定3～5種植物激素。本方法旨在建立高效液相色譜法同時分離測定果蔬中7種植物激素含量。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

番茄、黃瓜、辣椒、蘿卜、茄子、葡萄、蘋果、桃子、梨、西瓜 沈陽農(nóng)業(yè)大學果園。

甲醇、乙酸乙酯(純度大于99%) 國藥集團化學試劑有限公司；無水甲酸(純度大于99%) 沈陽化學試劑廠；甲醇(色譜純)、吲哚乙酸(IAA)、玉米素(ZTK)、萘乙酸(NAA)、脫落酸(ABA)、吲哚丁酸(IBA)、烯效唑(Uniconazole)、調(diào)吡脲(Forchlorfenuron)(純度均大于99%) Dikma公司。

1.2 儀器與設備

1100高效液相色譜儀(配有DAD紫外檢測器) 美國Agilent公司；C18固相萃取柱 Waters公司；C18色譜柱(250mm×46mm，5μm) Dikma公司；1602電子分析天平(萬分之一精度) 德國Satorius公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：C18色譜柱(250mm×46mm，5μm)；流動相：A：0.2%甲酸，B：甲醇；柱溫：35℃；進樣量20μL。

1.3.2 樣品處理

提?。悍Q取切碎后的樣品5g放入稱量瓶中，加入10mL體積分數(shù)80%甲醇提取劑，超聲振蕩15min，抽濾，用2×5mL的提取劑洗滌殘渣，抽濾，合并3次濾液，倒入雞心瓶中，用少量的甲醇沖洗布什漏斗內(nèi)壁，由旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(40℃)濃縮至水相[5]。

凈化：將濃縮后的水相調(diào)pH7.0，用乙酸乙酯進行液液萃取(3×5mL)，揮干乙酸乙酯，用5%甲醇1mL定容，過SPE-PAK C18固相萃取小柱，用4mL 40%甲醇溶液洗脫，收集上樣液和洗脫液(共5mL)，過0.45μm濾膜，即為待測液[6-11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的選擇

2.1.1 流動相的選擇

以甲醇-水溶液作為流動相7種激素不能完全分開，而且色譜峰拖尾嚴重，峰形較差。甲酸可以抑制樣品的電離，改善拖尾現(xiàn)象，因此在流動相中加入甲酸。在甲醇-水溶液中分別加入體積分數(shù)為1%、0.5%和0.2%的甲酸進行實驗，進樣質(zhì)量濃度1μg/mL，結(jié)果見圖1。

圖1 不同流動相7種植物激素色譜圖Fig.1 Chromatograms of 7 kinds of plant hormone using a 1%, 0.5% and 0.2% formic acid solution/methanol mixture as the mobile phase

由圖1可知，當加入甲酸體積分數(shù)為1%時，部分峰重疊，沒有完全分開；當加入甲酸體積分數(shù)為0.5%時，激素峰有拖尾現(xiàn)象；因此確定水相中的甲酸體積分數(shù)為0.2%，既能保證7種激素完全分開，又有效去除拖尾現(xiàn)象，使峰形最佳，并且可避免酸度過大損傷色譜柱填料。

2.1.2 梯度洗脫條件的確定

影響分離的最主要因素是梯度洗脫的選擇[12]，根據(jù)7種植物激素的性質(zhì)，分別對以下3種洗脫條件進行實驗，洗脫條件見表1，色譜圖見圖2。

表1 不同梯度洗脫條件的選擇Table 1 Screening of gradient elution program

由圖2可見，條件1中吲哚乙酸和脫落酸的色譜峰不能完全分開且α-萘乙酸的峰形不佳；條件3中吲哚丁酸和α-萘乙酸的色譜峰相隔較近且脫落酸稍有拖尾現(xiàn)象；相比之下條件2時，7種植物激素不但能夠得到較好的分離，且保證了出峰時間和峰形都較為適宜，故選擇條件2的梯度洗脫。

圖2 不同梯度洗脫條件7種植物激素的色譜圖Fig.2 Chromatograms of 7 kinds of plant hormone under gradient elution protocol No. 1, No. 2 and No. 3

2.27 種植物激素的線性范圍

配制10、5、2、1、0.5、0.1μg/mL質(zhì)量濃度的7種植物激素標準混合溶液，得出其線性方程及相關(guān)系數(shù)見表2，在0.5～10μg/mL線性關(guān)系良好。

表2 7種植物激素的線性范圍、線性方程及相關(guān)系數(shù)Table 2 Linear ranges, regression equations and correlation coefficients for the determination of 7 kinds of plant hormone

由表2可知，標準溶液質(zhì)量濃度在0.5～10μg/mL之間，質(zhì)量濃度與其色譜響應間呈線性，7種植物激素的線性方程的相關(guān)系數(shù)均大于0.997，呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系。

2.3 檢出限

在本實驗選定的色譜條件下，黃瓜添加0.2mg/kg植物激素標準品的色譜圖見圖3。

式中：C為樣品添加水平0.2mg/kg；信噪比RSN分別為玉米素24.5、吲哚乙酸39.3、脫落酸169.2、吲哚丁酸30.3、α-萘乙酸22.4、調(diào)吡脲105.1、烯效唑88。

圖3 添加0.2mg/kg的黃瓜樣品的色譜圖Fig.3 Chromatogram of cucumber sample with the addition of 0.2 mg/kg plant hormone

由式(1)計算得7種植物激素的最低檢出限分別為：玉米素0.02mg/kg、吲哚乙酸0.02mg/kg、脫落酸0.004mg/ kg、吲哚丁酸0.02mg/kg、α-萘乙酸0.02mg/kg、調(diào)吡脲0.006mg/kg、烯效唑0.007mg/kg。7種植物激素的最低檢出限范圍在0.004～0.02mg/kg之間。

式中：C為樣品添加水平0.2mg/kg；信噪比RSN分別為玉米素24.5、吲哚乙酸39.3、脫落酸169.2、吲哚丁酸30.3、α-萘乙酸22.4、調(diào)吡脲105.1、烯效唑88。

由式(2)計算得7種植物激素的最低定量限分別為玉米素0.1mg/kg、吲哚乙酸0.1mg/kg、脫落酸0.01mg/kg、吲哚丁酸0.1mg/kg、α-萘乙酸0.08mg/kg、調(diào)吡脲0.02mg/kg、烯效唑0.02mg/kg。7種植物激素的最低定量限范圍在0.01～0.1mg/kg之間。

2.4 精密度

以蘋果為例，在蘋果中添加3個水平的7種植物激素，測定的回收率和變異系數(shù)結(jié)果見表3。

表3 蘋果中7種植物激素加標回收率及精密度(n=5)Table 3 Recovery and RSD of 7 plant hormones in apple (n=5)

由表3可見，所有激素的添加回收率均在70.23%～98.10%之間，回收率的變異系數(shù)在3.34%～10.12%之間，回收效果較好，精密度較高。

3 結(jié) 論

實驗數(shù)據(jù)和圖譜表明該方法快速，靈敏度高、精密度好、準確度高。7種植物激素的最低檢出限分別為：玉米素0.02mg/kg、吲哚乙酸0.02mg/kg、脫落酸0.004mg/kg、吲哚丁酸0.02mg/kg、α-萘乙酸0.02mg/ kg、調(diào)吡脲0.006mg/kg、烯效唑0.007mg/kg；所有激素的添加回收率均在70.23%～98.10%之間，回收率的變異系數(shù)在3.34%～10.12%之間。該方法的最低檢出限為0.004～0.02mg/kg、最低定量限為0.01～0.1mg/kg，可滿足農(nóng)藥測定的要求，給相關(guān)部門對農(nóng)產(chǎn)品、食品的質(zhì)量監(jiān)控。

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Determination of Plant Hormone Residues in Vegetables and Fruits by High Performance Liquid Chromatography

ZHOU Yan-ming，XIN Xue
(Analysis and Testing Center, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China)

A high performance liquid chromatography (HPLC) method for determining plant hormone residues in vegetables and fruits was established. Sample preparation was accomplished after extraction with 80% methanol and clean-up on a C18 column prior to analysis using a HPLC system equipped with a UV detector and subsequent quantification by external standard method. The average spike recoveries for 10 species of vegetables or fruits such as tomato, cucumber, capsicum, etc were between 70.23% and 98.10%, with a variation coefficient ranging from 3.34% to 10.12%. The limit of detection of this method was between 0.004 mg/kg and 0.02 mg/kg, and the limit of quantification between 0.01 mg/kg and 0.1 mg/kg. This method meets the national requirements for pesticide determination and is applicable to food quality supervision and control.

high liquid chromatography；fruits and vegetables；plant hormone

TS207.53

A

1002-6630(2010)18-0301-04

2009-11-07

周艷明(1955—)，女，教授，碩士，研究方向為食品質(zhì)量與控制。E-mail：syauzym@163.com