高效液相色譜法檢測(cè)豬肉中安眠酮?dú)埩袅?/h1>
2010-03-23 08:43:31朱事康曹維強(qiáng)吳云普
食品科學(xué) 2010年18期
呂 飛，朱事康，黃 剛，曹維強(qiáng)，吳云普
(惠州出入境檢驗(yàn)檢疫局綜合技術(shù)中心，廣東 惠州 516006)
高效液相色譜法檢測(cè)豬肉中安眠酮?dú)埩袅?/p>
呂 飛，朱事康，黃 剛，曹維強(qiáng)，吳云普
(惠州出入境檢驗(yàn)檢疫局綜合技術(shù)中心，廣東 惠州 516006)
建立高效液相色譜法 (HPLC)檢測(cè)豬肉中安眠酮?dú)埩袅?。?jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)確定用二氯甲烷提取，固相萃取(SPE)柱凈化，流動(dòng)相定容后用高效液相色譜儀測(cè)定；采用乙腈:乙酸胺溶液(25mmol/L)=40:60(V/V)為流動(dòng)相，226nm為測(cè)定波長(zhǎng)，1.0mL/min的流速。在0.020～0.20mg/kg范圍內(nèi)具有良好的線(xiàn)性關(guān)系，最低檢測(cè)限為0.020mg/kg，回收率在70%～110%之間，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程為Y=6.90×104X+3.71×103，相關(guān)系數(shù)為0.999。此法操作簡(jiǎn)便、快速、靈敏、準(zhǔn)確，樣品處理簡(jiǎn)便易行，適用于測(cè)定豬肉中的安眠酮。
高效液相色譜法；豬肉；安眠酮；固相萃取
安眠酮(methaqualone)，又稱(chēng)甲苯喹啉酮。分子式C16H14N2O，相對(duì)分子質(zhì)量250.29。白色結(jié)晶粉末。無(wú)臭、微苦。熔點(diǎn)120℃。微溶于水，易溶于乙醇、乙醚、丙酮、氯仿等。有吸濕性、有鎮(zhèn)靜和催眠作用，適用于精神性失眠。
農(nóng)業(yè)部公布的《食用動(dòng)物禁用的獸藥及其它化合物清單》中有21類(lèi)近40個(gè)品種的原料藥及其單方、復(fù)方制劑產(chǎn)品停止使用，其中安眠酮也位列其中。安眠酮系喹唑酮類(lèi)衍生物，臨床上常用作催眠藥、鎮(zhèn)定藥[1]，主要用于動(dòng)物過(guò)度興奮或驚厥，可使機(jī)體平靜。但該藥副作用較大，消費(fèi)者誤食了含有安眠酮的豬肉，會(huì)表現(xiàn)出惡心、嘔吐、頭暈、無(wú)力、四肢及口舌麻木，個(gè)別較重患者有短時(shí)間的精神失常。過(guò)量中毒可出現(xiàn)昏迷、視神經(jīng)乳頭水腫、心跳過(guò)速、呼吸抑制等癥狀。久吃含有此藥的肉類(lèi)，人體可產(chǎn)生耐藥性。近年來(lái)，隨著畜牧養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展，一些不法分子在經(jīng)濟(jì)利益的驅(qū)動(dòng)下，置法律法規(guī)于不顧，擅自在畜禽飼養(yǎng)中添加使用，從而嚴(yán)重影響人們的身體健康。目前，在國(guó)內(nèi)動(dòng)物源性食品中安眠酮?dú)埩袅康臋z測(cè)還沒(méi)有相關(guān)的檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)[2-3]。本實(shí)驗(yàn)采用二氯甲烷提取，用高效液相色譜儀檢測(cè)，建立動(dòng)物源性食品中安眠酮?dú)埩袅康臏y(cè)定方法，以期為動(dòng)物源性食品的質(zhì)量控制提供一定的參考。
1 材料與方法
1.1 材料與試劑
豬瘦肉 惠州東進(jìn)肉聯(lián)廠。
安眠酮標(biāo)準(zhǔn)品(純度＞99.0%，質(zhì)量濃度10.000mg/L)；乙腈、甲醇、丙酮、正己烷、二氯甲烷(均為色譜純)德國(guó)Meker公司；乙腈飽和正己烷(色譜純)；乙酸胺、氫氧化鈉、無(wú)水硫酸鈉(均為分析純)；凈化用洗脫液：
乙腈+丙酮(體積比1:1)。除另有規(guī)定外，所用試劑均為分析純，水為GB/T 6682—2008《分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法》規(guī)定的一級(jí)水。
1.2 儀器與設(shè)備
高效液相色譜儀(帶2487紫外-可見(jiàn)波長(zhǎng)檢測(cè)器或2998二極管陣列檢測(cè)器)、Empower 2 工作站、固相萃取裝置、HLB C18SPE(3cc，60mg) 美國(guó)Waters公司；717Plus 自動(dòng)進(jìn)樣器 德祥科技有限公司；3-18K型離心機(jī) Sigma公司；R-210型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 Buchi公司；濾膜、快速定性濾紙。
1.3 方法
1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制
精確移取安眠酮標(biāo)準(zhǔn)品1.000mL，用乙腈稀釋并定容至10mL，搖勻，制備成質(zhì)量濃度為1.000mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。精確吸取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液2.0、5.0、10、20mL分別置于100mL容量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，使質(zhì)量濃度為0.02、0.05、0.10、0.20mg/L的標(biāo)準(zhǔn)使用液，使用前配制。以組分的峰面積為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，以外標(biāo)法定量。
1.3.2 色譜分離條件
色譜柱為Sunfire C18(250mm×4.6mm，5μm)；測(cè)定波長(zhǎng)為226nm；流動(dòng)相為乙腈:乙酸胺 (25mmol/L)=40: 60(V/V)；流速1.0mL/min；進(jìn)樣量20μL；柱溫40℃。
1.3.3 樣品處理
1.3.3.1 提取
稱(chēng)取5.0g(精確到0.01g)組織樣品和10g無(wú)水硫酸鈉于50mL離心管中，加入1mL 1mol/L NaOH溶液和20mL二氯甲烷，均質(zhì)提取1min，4000r/min離心5min，上清液經(jīng)快速定性濾紙過(guò)濾到100mL濃縮瓶中，殘?jiān)?0mL二氯甲烷超聲提取10min，4000r/min離心5min，合并二氯甲烷，40℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干。
1.3.3.2 凈化
殘留物中加入1mL流動(dòng)相，充分旋渦振蕩，轉(zhuǎn)移至5mL離心管中，加入3mL乙腈飽和正己烷，旋渦混勻，4000r/min離心5min，棄去上層正己烷層，原離心管中再加入3mL乙腈飽和正己烷，旋渦混勻，4000r/min離心5min，下層加0.1mol/L的NaOH溶液稀釋至5mL，作為待凈化液以備用。用3mL甲醇，3mL 0.1mol/L的NaOH以1mL/min的流速淋洗活化萃取柱，然后將5mL待凈化液通過(guò)柱子(控制流速小于0.5mL/min)，依次用3mL 0.1mol/L的NaOH溶液，3mL甲醇以1mL/min的流速過(guò)柱洗雜，最后用5mL乙腈-丙酮(體積比1:1)洗脫(控制流速小于0.5mL/min)，收集洗脫液于25mL濃縮瓶中，40℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，加1mL流動(dòng)相溶解殘?jiān)?，溶液過(guò)0.45μm有機(jī)相濾膜后上高效液相色譜儀測(cè)定。
1.3.4 樣品測(cè)定
取供上機(jī)檢測(cè)的樣品溶液20μL，注入高效液相色譜儀。根據(jù)樣液中安眠酮含量的情況，選取相應(yīng)值相近的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和待測(cè)樣液中安眠酮含量的相應(yīng)值均應(yīng)在儀器的線(xiàn)性范圍內(nèi)，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和樣液等體積參插進(jìn)樣測(cè)定。與標(biāo)準(zhǔn)的保留時(shí)間比較定性，外標(biāo)法定量。
2 結(jié)果與分析
2.1 樣品的預(yù)處理
2.1.1 提取溶劑的選擇
由于安眠酮易溶于乙醇、乙醚、丙酮、二氯甲烷、氯仿5種試劑做回收率比對(duì)實(shí)驗(yàn)，回收率分別為70.1%、82.5%、83.7%、91.4%、89.8%。二氯甲烷的回收率最高，所以用二氯甲烷作提取液。
2.1.2 樣品溶液pH值的調(diào)節(jié)[4]
安眠酮在弱堿性條件下更易溶于有機(jī)溶劑，考慮在提取液中加入了1mL 1mol/L NaOH溶液，調(diào)節(jié)pH值在8～9之間。分別做回收率比對(duì)實(shí)驗(yàn)，回收率為87.5% (pH8～9)和80.3%(未調(diào)pH值)，所以選擇在樣品提取液中加入了1mL 1mol/L NaOH溶液，控制pH值在8～9之間。
2.1.3 凈化時(shí)殘?jiān)芙庖旱倪x擇
選用二氯甲烷、乙腈及流動(dòng)相溶解殘留物。用二氯甲烷溶解時(shí)與正己烷互溶，嚴(yán)重的影響樣品的回收，不予考慮；用乙腈溶解時(shí)，雜質(zhì)干擾峰較多，綜合考慮采用流動(dòng)相溶解效果最好。
2.1.4 萃取柱凈化[5-7]
由于動(dòng)物肌肉中通常含有脂肪，首先需要脫脂步驟，在提取溶劑中加入正己烷，去除脂類(lèi)雜質(zhì)。若基質(zhì)比較干凈，則可直接裝瓶上機(jī)；若干擾峰較多，則要進(jìn)行固相萃取柱萃取。對(duì)OasisHLB、MCX、MAX不同極性的萃取柱進(jìn)行方法實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明：OasisHLB得到的回收率較高且穩(wěn)定，通過(guò)上柱條件，淋洗，洗脫各條件實(shí)驗(yàn)，最終確定的固相萃取條件如下：樣液轉(zhuǎn)移至已預(yù)先用3mL甲醇活化、3mL 0.1mol/L NaOH溶液平衡的OasisHLB固相萃取柱中，依次用3mL 0.1mol/L的NaOH溶液和3mL甲醇洗滌，抽至近干后，用洗脫液洗脫。實(shí)驗(yàn)表明，采用OasisHLB固相萃取柱處理樣品除雜質(zhì)效果好，分析物有高回收率、重現(xiàn)性好。
2.2 色譜條件的選擇
2.2.1 流動(dòng)相的選擇[8-9]
在所有條件相同的情況下，進(jìn)相同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。比較甲醇-水和乙腈-乙酸胺(25mmol/L)這兩種流動(dòng)相，分別取甲醇-水體積比為40:60、50:50、30:70，此流動(dòng)相在這3個(gè)比例的條件下均未出峰；乙腈-乙酸胺(25mmol/L)的體積比為30:70、45:55、40:60、75:25、
90:10、15:85，比較峰面積(圖1)，表明適合以乙腈:乙酸胺溶液(25mmol/L)=40:60(V/V)為流動(dòng)相。2.2.2檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇
圖1 流動(dòng)相比例與峰面積對(duì)應(yīng)關(guān)系柱形圖Fig.1 Relationship between mobile phase composition and peak area of methaqualone
在 200～400nm 范圍內(nèi)對(duì)安眠酮標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行掃描，安眠酮在 206、226、266、306、318nm 處有 5 個(gè)依次變低的吸收峰。參照文獻(xiàn)[8]最終確定檢測(cè)波長(zhǎng)為226nm。2.2.3色譜條件的確定[10]
考慮到Sunfire C18色譜柱針對(duì)堿性化合物能有效地改善分離度，在低和中等pH值流動(dòng)相條件下，對(duì)酸性、中性和堿性化合物都有杰出的柱效。且實(shí)驗(yàn)表明分離效果理想。在目標(biāo)峰附近無(wú)干擾峰。經(jīng)實(shí)驗(yàn)采用的色譜條件為：色譜柱為Sunfire C18(250mm×4.6mm，5μm)、柱溫為40℃、流動(dòng)相為乙腈-乙酸胺(25mmol/L)溶液(40:60，V/V)，流速為1.0mL/min，檢測(cè)器為紫外檢測(cè)器或二極管陣列檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)為226nm，進(jìn)樣量為20μL，安眠酮的保留時(shí)間約為8min左右，所得色譜峰峰形較好，并且實(shí)現(xiàn)了安眠酮與雜質(zhì)的良好分離。2.3標(biāo)準(zhǔn)色譜圖和樣品加標(biāo)色譜圖
3 結(jié) 論
圖2 安眠酮標(biāo)準(zhǔn)品液相色譜圖Fig.2 Liquid chromatogram of methaqualone standard
圖3 加標(biāo)樣品液相色譜圖Fig.3 Liquid chromatograms of a spiked sample
按照2.2.3節(jié)條件進(jìn)行色譜分析得到安眠酮的色譜圖，圖2為安眠酮的標(biāo)準(zhǔn)色譜圖，出峰時(shí)間在7.5min左右；圖3為豬肉樣0.020mg/kg標(biāo)品添加量回收色譜圖。
2.4 方法的線(xiàn)性關(guān)系
安眠酮在0.02～0.20mg/L內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系顯著。以峰面積-質(zhì)量濃度作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程為Y=6.90× 104X+3.71×103，相關(guān)系數(shù)為0.999。
2.5 最低檢測(cè)限
在RSN=3條件下確定安眠酮最低檢測(cè)限為0.020mg/kg。
2.6 方法的加標(biāo)回收率
表1 樣品加標(biāo)平均回收率(n=6)Table 1 Inter-and intra-laboratory average recovery rates of methaqualone (n=6)
由表1可見(jiàn)，在添加量在0.020～0.20mg/kg范圍內(nèi)，回收率在70%～110%之間，RSD在2.32%～3.90%之間，回收效果較好。
本實(shí)驗(yàn)旨在建立安眠酮的高效液相色譜檢測(cè)方法。用二氯甲烷提取，固相萃取(SPE)柱凈化，流動(dòng)相定容后用高效液相色譜儀測(cè)定。采用乙腈:乙酸胺溶液(25mmol/L)=40:60(V/V)為流動(dòng)相，226nm為測(cè)定波長(zhǎng)，1.0mL/min的流速色譜分析條件，可以實(shí)現(xiàn)動(dòng)物組織中安眠酮的檢測(cè)。此法操作簡(jiǎn)便、快速、靈敏、準(zhǔn)確，樣品處理簡(jiǎn)便易行，適用于測(cè)定豬肉中的安眠酮。
[1]郭幼梅, 諸秋珉, 姜宴. 用HPLC法同時(shí)檢測(cè)生物檢材中安眠酮及其2-羥甲基代謝物[J]. 上海醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 1996, 23(1): 43-45.
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Determination of Methaqualone Residues in Pork by High Performance Liquid Chromatography
(Center of Comprehensive Technology, Huizhou Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Huizhou 516006, China)
A high performance liquid chromatographic method was established to determine the content of methaqualone residues in pork. Sample extraction was carried out using dichloromethane as the extraction solvent, followed by clean-up on a solid-phase extraction column and dillution to a certain volum with the mobile phase composed of acetonitrile and 25 mmol/L ammonium acetate before injection onto HPLC system. The detection wavelength was 226 nm and the mobile phase flow rate was 1.0 mL/min. The calibration curve of the developed method was as follows: Y = 6.90 × 104X +3.71 × 103, with a correlation coefficient of 0.999, which exhibited good linearity over the concentration range from 0.020 to 0.20 mg/kg. The detection limit was 0.020 mg/kg, and the inter- and intra-laboratory average spike recovery rates of methaqualone at three levels were between 70% and 110%. This method has the benefits of simplicity, rapidity, high sensitivity, convenience and good feasibility and most suitable for the determination of methaqualone residues in pork.
high performance liquid chromatography；pork；methaqualone；SPE
TS207.3；R155.5
A
1002-6630(2010)18-0295-03
2009-12-16
呂飛(1978—)，女，工程師，在職碩士研究生，主要從事食品檢驗(yàn)研究。E-mail：lvfei1026@163.com
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高效液相色譜法；豬肉；安眠酮；固相萃取
安眠酮(methaqualone)，又稱(chēng)甲苯喹啉酮。分子式C16H14N2O，相對(duì)分子質(zhì)量250.29。白色結(jié)晶粉末。無(wú)臭、微苦。熔點(diǎn)120℃。微溶于水，易溶于乙醇、乙醚、丙酮、氯仿等。有吸濕性、有鎮(zhèn)靜和催眠作用，適用于精神性失眠。
農(nóng)業(yè)部公布的《食用動(dòng)物禁用的獸藥及其它化合物清單》中有21類(lèi)近40個(gè)品種的原料藥及其單方、復(fù)方制劑產(chǎn)品停止使用，其中安眠酮也位列其中。安眠酮系喹唑酮類(lèi)衍生物，臨床上常用作催眠藥、鎮(zhèn)定藥[1]，主要用于動(dòng)物過(guò)度興奮或驚厥，可使機(jī)體平靜。但該藥副作用較大，消費(fèi)者誤食了含有安眠酮的豬肉，會(huì)表現(xiàn)出惡心、嘔吐、頭暈、無(wú)力、四肢及口舌麻木，個(gè)別較重患者有短時(shí)間的精神失常。過(guò)量中毒可出現(xiàn)昏迷、視神經(jīng)乳頭水腫、心跳過(guò)速、呼吸抑制等癥狀。久吃含有此藥的肉類(lèi)，人體可產(chǎn)生耐藥性。近年來(lái)，隨著畜牧養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展，一些不法分子在經(jīng)濟(jì)利益的驅(qū)動(dòng)下，置法律法規(guī)于不顧，擅自在畜禽飼養(yǎng)中添加使用，從而嚴(yán)重影響人們的身體健康。目前，在國(guó)內(nèi)動(dòng)物源性食品中安眠酮?dú)埩袅康臋z測(cè)還沒(méi)有相關(guān)的檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)[2-3]。本實(shí)驗(yàn)采用二氯甲烷提取，用高效液相色譜儀檢測(cè)，建立動(dòng)物源性食品中安眠酮?dú)埩袅康臏y(cè)定方法，以期為動(dòng)物源性食品的質(zhì)量控制提供一定的參考。
1 材料與方法
1.1 材料與試劑
豬瘦肉 惠州東進(jìn)肉聯(lián)廠。
安眠酮標(biāo)準(zhǔn)品(純度＞99.0%，質(zhì)量濃度10.000mg/L)；乙腈、甲醇、丙酮、正己烷、二氯甲烷(均為色譜純)德國(guó)Meker公司；乙腈飽和正己烷(色譜純)；乙酸胺、氫氧化鈉、無(wú)水硫酸鈉(均為分析純)；凈化用洗脫液：
乙腈+丙酮(體積比1:1)。除另有規(guī)定外，所用試劑均為分析純，水為GB/T 6682—2008《分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法》規(guī)定的一級(jí)水。
1.2 儀器與設(shè)備
高效液相色譜儀(帶2487紫外-可見(jiàn)波長(zhǎng)檢測(cè)器或2998二極管陣列檢測(cè)器)、Empower 2 工作站、固相萃取裝置、HLB C18SPE(3cc，60mg) 美國(guó)Waters公司；717Plus 自動(dòng)進(jìn)樣器 德祥科技有限公司；3-18K型離心機(jī) Sigma公司；R-210型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 Buchi公司；濾膜、快速定性濾紙。
1.3 方法
1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制
精確移取安眠酮標(biāo)準(zhǔn)品1.000mL，用乙腈稀釋并定容至10mL，搖勻，制備成質(zhì)量濃度為1.000mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。精確吸取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液2.0、5.0、10、20mL分別置于100mL容量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，使質(zhì)量濃度為0.02、0.05、0.10、0.20mg/L的標(biāo)準(zhǔn)使用液，使用前配制。以組分的峰面積為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，以外標(biāo)法定量。
1.3.2 色譜分離條件
色譜柱為Sunfire C18(250mm×4.6mm，5μm)；測(cè)定波長(zhǎng)為226nm；流動(dòng)相為乙腈:乙酸胺 (25mmol/L)=40: 60(V/V)；流速1.0mL/min；進(jìn)樣量20μL；柱溫40℃。
1.3.3 樣品處理
1.3.3.1 提取
稱(chēng)取5.0g(精確到0.01g)組織樣品和10g無(wú)水硫酸鈉于50mL離心管中，加入1mL 1mol/L NaOH溶液和20mL二氯甲烷，均質(zhì)提取1min，4000r/min離心5min，上清液經(jīng)快速定性濾紙過(guò)濾到100mL濃縮瓶中，殘?jiān)?0mL二氯甲烷超聲提取10min，4000r/min離心5min，合并二氯甲烷，40℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干。
1.3.3.2 凈化
殘留物中加入1mL流動(dòng)相，充分旋渦振蕩，轉(zhuǎn)移至5mL離心管中，加入3mL乙腈飽和正己烷，旋渦混勻，4000r/min離心5min，棄去上層正己烷層，原離心管中再加入3mL乙腈飽和正己烷，旋渦混勻，4000r/min離心5min，下層加0.1mol/L的NaOH溶液稀釋至5mL，作為待凈化液以備用。用3mL甲醇，3mL 0.1mol/L的NaOH以1mL/min的流速淋洗活化萃取柱，然后將5mL待凈化液通過(guò)柱子(控制流速小于0.5mL/min)，依次用3mL 0.1mol/L的NaOH溶液，3mL甲醇以1mL/min的流速過(guò)柱洗雜，最后用5mL乙腈-丙酮(體積比1:1)洗脫(控制流速小于0.5mL/min)，收集洗脫液于25mL濃縮瓶中，40℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，加1mL流動(dòng)相溶解殘?jiān)?，溶液過(guò)0.45μm有機(jī)相濾膜后上高效液相色譜儀測(cè)定。
1.3.4 樣品測(cè)定
取供上機(jī)檢測(cè)的樣品溶液20μL，注入高效液相色譜儀。根據(jù)樣液中安眠酮含量的情況，選取相應(yīng)值相近的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和待測(cè)樣液中安眠酮含量的相應(yīng)值均應(yīng)在儀器的線(xiàn)性范圍內(nèi)，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和樣液等體積參插進(jìn)樣測(cè)定。與標(biāo)準(zhǔn)的保留時(shí)間比較定性，外標(biāo)法定量。
2 結(jié)果與分析
2.1 樣品的預(yù)處理
2.1.1 提取溶劑的選擇
由于安眠酮易溶于乙醇、乙醚、丙酮、二氯甲烷、氯仿5種試劑做回收率比對(duì)實(shí)驗(yàn)，回收率分別為70.1%、82.5%、83.7%、91.4%、89.8%。二氯甲烷的回收率最高，所以用二氯甲烷作提取液。
2.1.2 樣品溶液pH值的調(diào)節(jié)[4]
安眠酮在弱堿性條件下更易溶于有機(jī)溶劑，考慮在提取液中加入了1mL 1mol/L NaOH溶液，調(diào)節(jié)pH值在8～9之間。分別做回收率比對(duì)實(shí)驗(yàn)，回收率為87.5% (pH8～9)和80.3%(未調(diào)pH值)，所以選擇在樣品提取液中加入了1mL 1mol/L NaOH溶液，控制pH值在8～9之間。
2.1.3 凈化時(shí)殘?jiān)芙庖旱倪x擇
選用二氯甲烷、乙腈及流動(dòng)相溶解殘留物。用二氯甲烷溶解時(shí)與正己烷互溶，嚴(yán)重的影響樣品的回收，不予考慮；用乙腈溶解時(shí)，雜質(zhì)干擾峰較多，綜合考慮采用流動(dòng)相溶解效果最好。
2.1.4 萃取柱凈化[5-7]
由于動(dòng)物肌肉中通常含有脂肪，首先需要脫脂步驟，在提取溶劑中加入正己烷，去除脂類(lèi)雜質(zhì)。若基質(zhì)比較干凈，則可直接裝瓶上機(jī)；若干擾峰較多，則要進(jìn)行固相萃取柱萃取。對(duì)OasisHLB、MCX、MAX不同極性的萃取柱進(jìn)行方法實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明：OasisHLB得到的回收率較高且穩(wěn)定，通過(guò)上柱條件，淋洗，洗脫各條件實(shí)驗(yàn)，最終確定的固相萃取條件如下：樣液轉(zhuǎn)移至已預(yù)先用3mL甲醇活化、3mL 0.1mol/L NaOH溶液平衡的OasisHLB固相萃取柱中，依次用3mL 0.1mol/L的NaOH溶液和3mL甲醇洗滌，抽至近干后，用洗脫液洗脫。實(shí)驗(yàn)表明，采用OasisHLB固相萃取柱處理樣品除雜質(zhì)效果好，分析物有高回收率、重現(xiàn)性好。
2.2 色譜條件的選擇
2.2.1 流動(dòng)相的選擇[8-9]
在所有條件相同的情況下，進(jìn)相同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。比較甲醇-水和乙腈-乙酸胺(25mmol/L)這兩種流動(dòng)相，分別取甲醇-水體積比為40:60、50:50、30:70，此流動(dòng)相在這3個(gè)比例的條件下均未出峰；乙腈-乙酸胺(25mmol/L)的體積比為30:70、45:55、40:60、75:25、
90:10、15:85，比較峰面積(圖1)，表明適合以乙腈:乙酸胺溶液(25mmol/L)=40:60(V/V)為流動(dòng)相。2.2.2檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇
圖1 流動(dòng)相比例與峰面積對(duì)應(yīng)關(guān)系柱形圖Fig.1 Relationship between mobile phase composition and peak area of methaqualone
在 200～400nm 范圍內(nèi)對(duì)安眠酮標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行掃描，安眠酮在 206、226、266、306、318nm 處有 5 個(gè)依次變低的吸收峰。參照文獻(xiàn)[8]最終確定檢測(cè)波長(zhǎng)為226nm。2.2.3色譜條件的確定[10]
考慮到Sunfire C18色譜柱針對(duì)堿性化合物能有效地改善分離度，在低和中等pH值流動(dòng)相條件下，對(duì)酸性、中性和堿性化合物都有杰出的柱效。且實(shí)驗(yàn)表明分離效果理想。在目標(biāo)峰附近無(wú)干擾峰。經(jīng)實(shí)驗(yàn)采用的色譜條件為：色譜柱為Sunfire C18(250mm×4.6mm，5μm)、柱溫為40℃、流動(dòng)相為乙腈-乙酸胺(25mmol/L)溶液(40:60，V/V)，流速為1.0mL/min，檢測(cè)器為紫外檢測(cè)器或二極管陣列檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)為226nm，進(jìn)樣量為20μL，安眠酮的保留時(shí)間約為8min左右，所得色譜峰峰形較好，并且實(shí)現(xiàn)了安眠酮與雜質(zhì)的良好分離。2.3標(biāo)準(zhǔn)色譜圖和樣品加標(biāo)色譜圖
3 結(jié) 論
圖2 安眠酮標(biāo)準(zhǔn)品液相色譜圖Fig.2 Liquid chromatogram of methaqualone standard
圖3 加標(biāo)樣品液相色譜圖Fig.3 Liquid chromatograms of a spiked sample
按照2.2.3節(jié)條件進(jìn)行色譜分析得到安眠酮的色譜圖，圖2為安眠酮的標(biāo)準(zhǔn)色譜圖，出峰時(shí)間在7.5min左右；圖3為豬肉樣0.020mg/kg標(biāo)品添加量回收色譜圖。
2.4 方法的線(xiàn)性關(guān)系
安眠酮在0.02～0.20mg/L內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系顯著。以峰面積-質(zhì)量濃度作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程為Y=6.90× 104X+3.71×103，相關(guān)系數(shù)為0.999。
2.5 最低檢測(cè)限
在RSN=3條件下確定安眠酮最低檢測(cè)限為0.020mg/kg。
2.6 方法的加標(biāo)回收率
表1 樣品加標(biāo)平均回收率(n=6)Table 1 Inter-and intra-laboratory average recovery rates of methaqualone (n=6)
由表1可見(jiàn)，在添加量在0.020～0.20mg/kg范圍內(nèi)，回收率在70%～110%之間，RSD在2.32%～3.90%之間，回收效果較好。
本實(shí)驗(yàn)旨在建立安眠酮的高效液相色譜檢測(cè)方法。用二氯甲烷提取，固相萃取(SPE)柱凈化，流動(dòng)相定容后用高效液相色譜儀測(cè)定。采用乙腈:乙酸胺溶液(25mmol/L)=40:60(V/V)為流動(dòng)相，226nm為測(cè)定波長(zhǎng)，1.0mL/min的流速色譜分析條件，可以實(shí)現(xiàn)動(dòng)物組織中安眠酮的檢測(cè)。此法操作簡(jiǎn)便、快速、靈敏、準(zhǔn)確，樣品處理簡(jiǎn)便易行，適用于測(cè)定豬肉中的安眠酮。
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Determination of Methaqualone Residues in Pork by High Performance Liquid Chromatography
(Center of Comprehensive Technology, Huizhou Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Huizhou 516006, China)
A high performance liquid chromatographic method was established to determine the content of methaqualone residues in pork. Sample extraction was carried out using dichloromethane as the extraction solvent, followed by clean-up on a solid-phase extraction column and dillution to a certain volum with the mobile phase composed of acetonitrile and 25 mmol/L ammonium acetate before injection onto HPLC system. The detection wavelength was 226 nm and the mobile phase flow rate was 1.0 mL/min. The calibration curve of the developed method was as follows: Y = 6.90 × 104X +3.71 × 103, with a correlation coefficient of 0.999, which exhibited good linearity over the concentration range from 0.020 to 0.20 mg/kg. The detection limit was 0.020 mg/kg, and the inter- and intra-laboratory average spike recovery rates of methaqualone at three levels were between 70% and 110%. This method has the benefits of simplicity, rapidity, high sensitivity, convenience and good feasibility and most suitable for the determination of methaqualone residues in pork.
high performance liquid chromatography；pork；methaqualone；SPE
TS207.3；R155.5
A
1002-6630(2010)18-0295-03
2009-12-16
呂飛(1978—)，女，工程師，在職碩士研究生，主要從事食品檢驗(yàn)研究。E-mail：lvfei1026@163.com
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