苗敬芝，呂興軍*，董玉瑋，高明俠，曹澤虹

(徐州工程學(xué)院食品工程學(xué)院，江蘇省食品生物加工工程技術(shù)研究中心， 江蘇 徐州 221008)

共固定化酶提取花生多糖工藝優(yōu)化

苗敬芝，呂興軍*，董玉瑋，高明俠，曹澤虹

(徐州工程學(xué)院食品工程學(xué)院，江蘇省食品生物加工工程技術(shù)研究中心， 江蘇 徐州 221008)

以花生粕為原料，采用共固定化酶提取花生多糖，并對(duì)其工藝條件進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)。結(jié)果表明：花生多糖的最佳提取條件為酸性蛋白酶和木瓜蛋白酶各10%、固液比1:20(g/mL)、時(shí)間5h、pH5.0。采用共固定化酶提取花生多糖提取率為10.88%，共固定化酶重復(fù)使用7次，酶活力仍保持50%以上。

共固定化酶；提取；花生；多糖

花生(Arachis hypogaed)是世界上的四大油料作物之一，約占世界油料的14%[1]。我國花生的產(chǎn)量居世界第一位，花生榨油后的花生粕中含有40%以上的蛋白質(zhì)，碳水化合物和多糖等物質(zhì)，目前人們對(duì)花生粕提取蛋白質(zhì)工藝研究較多[2-3]，但對(duì)從花生粕中提取多糖的研究?jī)H剛開始[4-5]。多糖作為藥物進(jìn)行研究和開發(fā)起始于20世紀(jì)40年代，由于多糖具有獨(dú)特的生物活性，近年來，對(duì)植物多糖的研究發(fā)展很快，其中對(duì)多糖的免疫機(jī)理，抗腫瘤、抗衰老和降血糖等功效的研究以達(dá)到分子水平[6-7]。多糖的提取方法很多，主要有水提取[8]、酸提取、堿提取和酶法提取等[9]，其中酶法[10]提取對(duì)多糖的結(jié)構(gòu)破壞性小、提取率高。本實(shí)驗(yàn)嘗試?yán)霉补潭柑崛』ㄉ啥嗵?，探討其提取的最佳工藝條件，為后續(xù)對(duì)花生粕中多糖的開發(fā)和利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

花生粕由徐州新沂崇本堂農(nóng)產(chǎn)品開發(fā)有限公司提供，粗蛋白含量44.75%。

酸性蛋白酶(5萬U/g)、木瓜蛋白酶(65萬U/g) 天津市諾實(shí)科技發(fā)展有限公司；海藻酸鈉 國藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑有限公司；戊二醛 天津福晨化學(xué)試劑廠；無水氯化鈣 天津基準(zhǔn)化學(xué)試劑有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純或生化試劑。

1.2 儀器與設(shè)備

TU-1810PC型紫外分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限公司；7230型可見分光光度計(jì)、DZF6020型真空干燥箱 上海精密科學(xué)有限公司； HYG-1 轉(zhuǎn)式恒溫調(diào)速

柜 上海欣蕊自動(dòng)化設(shè)備有限公司；DL-5大容量離心機(jī)上海安亭科學(xué)儀器廠；1700型高效液相色譜儀 Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 共固定化酶制備的方法

參照高明俠等[11]的實(shí)驗(yàn)方法，取酸性蛋白酶和木瓜蛋白酶各250mL(酸性蛋白酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%、木瓜蛋白酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%)，按1:1體積比加入到3g/100mL的海藻酸鈉溶液中，充分混合后，在振蕩器上振蕩30min，用4號(hào)針頭注入500mL 0.2g/100mL的CaCl2溶液中，4℃冰箱硬化2h，濾出小球體，加入到戊二醛溶液中交聯(lián)6h，用蒸餾水洗掉小球體上未固定化的酶類，然后用230nm波長(zhǎng)檢測(cè)吸收峰，印三酮反應(yīng)無色，用濾紙吸干，放置4℃冰箱保存?zhèn)溆?。其他固定化酶制備與此相同。共固定化酶中酸性蛋白酶比活力為22.77U/mg，木瓜蛋白酶比活力為249.80U/mg。

1.3.2 共固定化酶活力測(cè)定[12]

以苯甲酰-L-精氨酸乙酯(BAEE)為底物，用紫外分光光度法測(cè)定。在具塞試管中加入固定化酶0.3g，酶激活劑3mL，37℃水溶中預(yù)熱10min，加入酪蛋白溶液10mL，攪勻后在37℃水溶中精確反應(yīng)10min，然后加入10mL三氯醋酸溶液，劇烈搖動(dòng)后，37℃水溶放置30min，在275nm處測(cè)定吸光度。

1.3.3 多糖含量測(cè)定

采用苯酚-硫酸法[13]進(jìn)行，在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，同時(shí)做空白實(shí)驗(yàn)，計(jì)算多糖提取率。

1.3.4 共固定化酶提取花生多糖工藝流程

其中，Sevag法脫蛋白需多次重復(fù)，直至紫外分光光度計(jì)在260、280nm處無吸收為止。

1.3.5 共固定化酶提取花生多糖工藝條件選擇[14-15]

為了獲得花生粕多糖提取的最佳工藝條件，本實(shí)驗(yàn)選擇pH值、時(shí)間、固液比和加酶量4因素3水平進(jìn)行正交試驗(yàn)，見表1。根據(jù)固定化酶小球中的酶含量，根據(jù)加酶量，稱取一定量固定化酶小球加入到花生粕液中，酶解。在2.2節(jié)中因加入的共固定化酶兩種酶的濃度相同，簡(jiǎn)寫為一個(gè)百分比。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels in the orthogonal array design

1.3.6 共固定化酶穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)[16]

采用共固定化酶提取花生多糖，重復(fù)使用后，測(cè)定多糖提取率，觀察酶活力保持50%以上時(shí)的最高使用次數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 共固定化酶組合對(duì)多糖提取的效應(yīng)

在固液比1:20(g/mL)、加酶量10%、溫度和pH值按每組酶的最適溫度和pH值調(diào)節(jié)，共酶解5h，結(jié)果見表2。

表2 共固定化酶組合對(duì)多糖提取的影響Table 2 Effect of different enzyme combinations on polysaccharide yield

由表2可見，選用酸性蛋白酶加木瓜蛋白酶的組合，提取花生多糖的效果最好，提取率為9.18%。

2.2 共固定化酶量對(duì)多糖提取的影響

圖1 加酶量對(duì)多糖提取率的影響Fig.1 Effect of enzyme concentration for immobilization on polysaccharide yield

共固定化酶中酸性蛋白酶和堿性蛋白酶加酶量為2%、4%、6%、8%、10%和12%，酶解溫度50℃，pH5.0，固液比1:20，酶解時(shí)間5h，結(jié)果見圖1。

由圖1可知，隨著共固定化兩種加酶量的增加，多糖提取率也逐漸增加，當(dāng)酶添加量大于10%時(shí)，多糖提取率最高，酶添加量確定為10%。

2.2.1 固液比對(duì)共固定化酶提取多糖的影響

在加酶量10%、pH5.0、溫度50℃、時(shí)間5h條件下，選用花生粕與水不同固液比提取多糖，結(jié)果見圖2。

圖2 固液比對(duì)多糖提取的影響Fig.2 Effect of solid/liquid ratio on polysaccharide yield

由圖2可知，隨著固液比的增加，多糖的提取率也逐漸增加，當(dāng)固液比為1:20時(shí)，多糖的提取率最高為10.12%，當(dāng)固液比再增加時(shí)，多糖的提取率逐漸降低，固液比確定為1:20。

2.2.2 反應(yīng)溫度對(duì)共固定化酶提取多糖的影響

在pH5.0、固液比1:20、加酶量10%、酶解時(shí)間5h條件下，選用不同的溫度提取多糖，結(jié)果見圖3。

圖3 共固定化酶反應(yīng)溫度對(duì)多糖提取的影響Fig.3 Effect of hydrolysis temperature on polysaccharide yield

由圖3可知，共固定化酶解花生粕反應(yīng)溫度在50℃時(shí)，多糖提取率最高為9.85%，確定提取溫度為50℃。

2.2.3 共固定化酶反應(yīng)時(shí)間對(duì)多糖提取的影響

在共固定化酶加酶量10%、pH5.0、50℃條件下分別反應(yīng)2、3、4、5、6h和7h，結(jié)果見圖4。

由圖4可知，隨著共固定化酶反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，多糖的提取率也隨之增加，當(dāng)酶解時(shí)間為5h時(shí)，多糖的提取率最高為9.80%，確定酶解時(shí)間為5h。

圖4 共固定化酶反應(yīng)時(shí)間對(duì)多糖提取的影響Fig.4 Effect of hydrolysis duration on polysaccharide yield

2.2.4 共固定化酶反應(yīng)pH值對(duì)多糖提取的影響

在共固定化酶加酶量10%、溫度50℃、時(shí)間5h條件下pH值分別控制在2、3、4、5、6和7，結(jié)果見圖5。

圖5 共固定化酶反應(yīng)pH值對(duì)多糖提取的影響Fig.5 Effect of hydrolysis pH on polysaccharide yield

由圖5可知，共固定化酶反應(yīng)的pH值對(duì)花生粕提取多糖有較大的影響，當(dāng)pH值小于5時(shí)，隨著pH值的升高，多糖的提取率也逐漸增加，當(dāng)pH值超過5時(shí)，多糖的提取率逐漸降低，可見pH5時(shí)是最佳提取條件。

2.3 共固定化酶提取花生多糖正交試驗(yàn)

表3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Orthogonal array design arrangement and experimental results

采用正交試驗(yàn)優(yōu)化共固定化酶提取花生多糖，篩選

最佳條件組合，結(jié)果見表3。

由表3可以看出，在4個(gè)因素中對(duì)多糖提取率影響順序?yàn)榧矗篋＞C＞B＞A，加酶量對(duì)花生多糖的提取率影響最大，其次是固液比、時(shí)間和pH值，按照極差分析所得的最佳工藝條件為A1B3C2D3，即pH5、時(shí)間5h、固液比1:20、加酶量酸性蛋白酶和木瓜蛋白酶各10%。根據(jù)此工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果多糖提取率平均值為10.88%，可以認(rèn)為極差分析所獲得的條件是多糖提取的最佳工藝條件。

2.4 共固定化酶穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

采用共固定化酶提取花生多糖，重復(fù)使用后，考察對(duì)多糖提取保持50%，酶活力的使用次數(shù)，結(jié)果見圖6。

圖6 共固定化酶的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)Fig.6 Repeated usability evaluation for co-immobilized acidic protease and papain

由圖6可知，使用共固定化酶提取花生多糖，第1次提取率為10.88%，當(dāng)使用到第7次后多糖的提取率仍為5.40%，共固定化酶的活力仍保持在50%左右。說明共固定化酶具有良好的穩(wěn)定性，此種結(jié)果與苗敬芝等[17]用固定化酶水解烏雞肉制備功能肽的研究相似。

3 結(jié) 論

利用共固定化酶提取花生多糖的最佳工藝條件：酸性蛋白酶和木瓜蛋白酶各10%，固液比1:20，時(shí)間5h， pH5.0，花生多糖提取率為10.88%。共固定化酶重復(fù)使用7次，共固定化酶的活力仍保持在50%以上。

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Orthogonal Array Optimization of Extraction of Peanut Polysaccharides Based on the Use of Co-Immobilized Enzymes

MIAO Jing-zhi，LXing-jun*，DONG Yu-wei，GAO Ming-xia，CAO Ze-hong
(Jiangsu Food Bioprocessing Engineering Research Center, School of Food Engineering, Xuzhou Institute of Technology, Xuzhou 221008, China)

Eight common proteases of the same concentrations were co-immobilized pairwise into sodium alginate beads at a volume ratio of 1:1 in order to provide co-immobilized enzymes for hydrolyzing peanut meal to obtain polysaccharides. The hydrolysis process of peanut meal based on the use of co-immobilized enzymes was optimized. Combination of acidic protease and papain gave a maximum polysaccharide yield among six combinations and the optimal conditions for hydrolyzing peanut meal with this combination were as follows: enzyme concentration for immobilization 10%; solid/liquid ratio 1:20; pH 5.0; and hydrolysis duration 5 h. A polysaccharide yield of 10.88% was achieved under these conditions. After repeated use for 7 times, the co-immobilized enzymes still had an activity exceeding 50% of the original activity.

co-immobilized enzymes; extraction；peanut；polysaccharides

Q814.2；S565.2

A

1002-6630(2010)18-0157-04

2010-06-19

江蘇省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(BE2006308)

苗敬芝(1964—)，女，副教授，本科，主要從事食品生物技術(shù)研究。E-mail：miaojingzhi6466@163.com

*通信作者：呂興軍(1958—)，男，高級(jí)工程師，本科，主要從事食品工程研究。E-mail：miaojingzhi6466@163.com