張 宇，呂鳳霞*，趙海珍，劉建偉，別小妹，陸兆新

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院酶工程研究室，江蘇 南京 210095)

脂肪酶催化豬油合成L-抗壞血酸脂肪酸酯工藝條件

張 宇，呂鳳霞*，趙海珍，劉建偉，別小妹，陸兆新

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院酶工程研究室，江蘇 南京 210095)

研究一種L-抗壞血酸脂肪酸酯酶法合成的新途徑。以廉價(jià)的豬油和L-抗壞血酸作為反應(yīng)底物，探討酶法合成L-抗壞血酸脂肪酸酯的工藝條件。結(jié)果表明，在該酶促反應(yīng)中，混合有機(jī)溶劑體系中底物轉(zhuǎn)化率高于相應(yīng)純有機(jī)溶劑體系中的轉(zhuǎn)化率，最佳反應(yīng)體系為30%叔戊醇:70%異辛烷(V/V)。研究各反應(yīng)因素對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響，確定最適反應(yīng)條件為底物L(fēng)-抗壞血酸與復(fù)合豬油甲酯的物質(zhì)的量比為1:10、酶量10%、溫度55℃、反應(yīng)時(shí)間24h，轉(zhuǎn)化率可達(dá)到(52.7±2.8)%。

脂肪酶；豬油；酶法合成；抗壞血酸脂肪酸酯

L-抗壞血酸脂肪酸酯(L-ascorbyl fatty acid esters，AFAE)是一種新型的多功能食品添加劑。由于其既含有親水性的L-抗壞血酸，又含有親油性的脂肪酸鏈，使得它兼具脂溶性抗氧化劑和食品乳化劑的特性，在食品工業(yè)中具有廣泛的用途[1-2]。

L-抗壞血酸脂肪酸酯的合成主要有化學(xué)合成法[3]和酶催化合成法[4]兩類(lèi)。其中化學(xué)合成法因成本低、收率高等優(yōu)點(diǎn)在工業(yè)生產(chǎn)上廣泛應(yīng)用。但化學(xué)合成方法副反應(yīng)多，得到的產(chǎn)品有害物質(zhì)含量高，很難達(dá)到綠色食品添加劑的要求，而且該工藝還存在能耗高、對(duì)設(shè)備要求高、環(huán)境污染較為嚴(yán)重等問(wèn)題。與化學(xué)合成法相比，L-抗壞血酸脂肪酸酯的酶法合成具有反應(yīng)選擇性高、反應(yīng)條件溫和、副反應(yīng)少、轉(zhuǎn)化率高和產(chǎn)品下游分離操作相對(duì)簡(jiǎn)單、對(duì)設(shè)備要求不高等優(yōu)點(diǎn)，完全符合綠色化工的發(fā)展趨勢(shì)。盡管目前酶法合成L-抗壞血酸脂肪酸酯的工業(yè)化生產(chǎn)因酶的應(yīng)用環(huán)境以及成本高的問(wèn)題還沒(méi)有實(shí)現(xiàn)，但它代表了未來(lái)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展方向。

在酶催化法合成L-抗壞血酸脂肪酸酯的研究中，脂肪酶和溶劑的選擇、最佳反應(yīng)條件的確定以及經(jīng)濟(jì)性底物的采用成為酶催化合成法發(fā)展的關(guān)鍵。以廉價(jià)的畜牧業(yè)加工副產(chǎn)品——豬油和L-抗壞血酸為原料，利用生物催化手段制備的L-抗壞血酸脂肪酸酯是一種混合性酯。該混合性酯既含有不飽和脂肪酸，又有飽和脂肪酸，在抗氧化的同時(shí)還具有可以提供給人體多種脂肪酸和L-抗

壞血酸的生理學(xué)效價(jià)的特性，屬于一種高效、營(yíng)養(yǎng)、多功能食品添加劑，符合目前綠色食品添加劑安全、營(yíng)養(yǎng)、多功能的發(fā)展趨勢(shì)。目前，有關(guān)脂肪酶催化豬油合成抗壞血酸脂肪酸酯的研究，國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)探索以脂肪酶為催化劑以及豬油甲酯和L-抗壞血酸為反應(yīng)底物，酶法合成L-抗壞血酸脂肪酸酯的新途徑，為研制開(kāi)發(fā)新型食品添加劑提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

脂肪酶：固定化脂肪酶Lipozyme TL IM(T. lanuginosus)、Novozyme 435(Candida Antarctica)、Lipozyme RM IM(Rhizomucor miehei) 丹麥Novozyme酶制劑公司。游離態(tài)粉末脂肪酶FAP-15(Rhizopus oryzae)、Amnao10(Mucor javanicus) 日本Amnao酶制劑公司。

精制豬油 連云港油脂有限公司；L-抗壞血酸棕櫚酸酯標(biāo)樣 德國(guó)Sigma-Aldrich公司；其他L-抗壞血酸脂肪酸酯標(biāo)樣由本實(shí)驗(yàn)室自制；其他試劑和有機(jī)溶劑均為分析純或色譜純。

1.2 方法

1.2.1 復(fù)合豬油甲酯的制備

取干凈的三口燒瓶，加入100g精制豬油，再加入20.6mL甲醇和0.5g NaOH，裝上回流和攪拌裝置，在反應(yīng)溫度60℃，充分?jǐn)嚢柘路磻?yīng)2h。反應(yīng)結(jié)束后蒸餾出過(guò)量的甲醇，并移入分液漏斗，靜置后分離出下層的甘油。將得到的粗豬油甲酯用水洗滌數(shù)次至中性后，再用NaCl飽和水溶液洗滌一次，可得到油狀的復(fù)合豬油甲酯，備用。

1.2.2 L-抗壞血酸脂肪酸酯的合成

典型反應(yīng)為：0.1mmol/L L-抗壞血酸、0.2mmol/L的復(fù)合豬油甲酯加入裝有20mL反應(yīng)介質(zhì)的具塞三角瓶中，在反應(yīng)溫度下預(yù)熱使反應(yīng)物溶解并混合均勻，然后加入10%固定化脂肪酶。反應(yīng)混合物在55℃旋轉(zhuǎn)水浴鍋中以180r/min的轉(zhuǎn)速反應(yīng)24h。所有反應(yīng)進(jìn)行兩個(gè)重復(fù)，取其平均值。

1.2.3 L-抗壞血酸脂肪酸酯的HPLC分析

取20 μL反應(yīng)液進(jìn)行HPLC分析。HPLC系統(tǒng)為美國(guó)Agilent公司儀器，配有UV檢測(cè)器和ZORBAX SB C18色譜柱(4.6mm×250mm，5μm)，柱體溫度保持在30℃，以乙腈-甲醇(1‰三氟乙酸)-水(1‰三氟乙酸)作為洗脫液，流動(dòng)相流速保持在1.0mL/min，檢測(cè)器波長(zhǎng)245nm，整個(gè)洗脫過(guò)程約45min。采用外標(biāo)法進(jìn)行產(chǎn)物的定量。標(biāo)準(zhǔn)L-抗壞血酸脂肪酸酯的HPLC圖譜見(jiàn)圖1。

1.2.4 轉(zhuǎn)化率的測(cè)定

以反應(yīng)體系中生成的L-抗壞血酸脂肪酸酯的量計(jì)算轉(zhuǎn)化率(轉(zhuǎn)化率均以L(fǎng)-抗壞血酸為基準(zhǔn)進(jìn)行計(jì)算)：

圖1 L-抗壞血酸脂肪酸酯的HPLC圖譜Fig.1 HPLC chromatogram of standard AFAE

2 結(jié)果與分析

2.1 脂肪酶的篩選

在酯交換反應(yīng)中用于催化反應(yīng)的脂肪酶類(lèi)型，對(duì)于產(chǎn)物產(chǎn)率和組成而言是一個(gè)決定性因素。為了確定一種催化活性最佳的脂肪酶，按1.2.2節(jié)方法對(duì)Lipozyme TL IM、Novozyme 435、Lipozyme RM IM、FAP-15和Amnao10等脂肪酶進(jìn)行篩選。結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 脂肪酶對(duì)反應(yīng)轉(zhuǎn)化率的影響Fig.2 Effect of lipase type on the conversion ratio of L-ascorbic acid

由圖2可以看出，不同脂肪酶催化的反應(yīng)轉(zhuǎn)化率不同。在叔戊醇反應(yīng)體系中，5種脂肪酶的催化活性從高到低依次：Novozyme 435＞Lipozyme RM IM＞Lipozyme TL IM＞Amnao10＞FAP-15。以固定化脂肪酶Novozyme 435的催化活性最高，而游離酶的催化活性比較低。這可能是因?yàn)槊腹潭ɑ?，提高了其?duì)外界環(huán)境如溫度、pH值等的穩(wěn)定性，從而在反應(yīng)體系中保持了比較高的催化活性。而游離酶由于直接同有機(jī)溶劑接觸，酶的活性位點(diǎn)容易受到有機(jī)溶劑破壞或改變，從而導(dǎo)致酶活的降低或失活?？傊?，由于固定化酶Novozyme 435表現(xiàn)出了高的催化活性，因此就選用固定化酶Novozyme 435作為催化劑進(jìn)行下一步的研究。

2.2 反應(yīng)體系對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響

大量的研究表明，有機(jī)溶劑作為酶反應(yīng)的反應(yīng)介質(zhì)

會(huì)直接影響酶的催化活性和穩(wěn)定性[5-8]。Laane等[6]用有機(jī)溶劑的極性參數(shù)lgP來(lái)描述有機(jī)溶劑對(duì)酶反應(yīng)的影響(lgP是該有機(jī)溶劑在正辛醇-水體系中的分配系數(shù)的對(duì)數(shù))。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，lgP＜2的極性溶劑不適合作為反應(yīng)介質(zhì)，因?yàn)槿軇O性極強(qiáng)，容易奪取酶分子表面水層而使酶活性降低；lgP在2～4之間的溶劑對(duì)酶的必需水有微弱破壞，對(duì)酶活性有影響但很難預(yù)測(cè)，酶在溶劑中一般可以表現(xiàn)出中等活性；lgP＞4的非極性溶劑一般不破壞酶分子表面水層，這類(lèi)溶劑是較為理想的。本實(shí)驗(yàn)選擇了3種常用的有機(jī)溶劑和其混合溶劑作為反應(yīng)介質(zhì)，其轉(zhuǎn)化率見(jiàn)表1。

表1 有機(jī)溶劑對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響Table 1 Effect of reaction medium composition on the conversion ratio of L-ascorbic acid

由表1可見(jiàn)，在相同的反應(yīng)條件下，混合溶劑中的轉(zhuǎn)化率要高于單純?nèi)軇┲械霓D(zhuǎn)化率，這主要是因?yàn)樵诿复購(gòu)?fù)合脂肪酸甲酯與L-抗壞血酸合成L-抗壞血酸脂肪酸酯的過(guò)程中，反應(yīng)副產(chǎn)物甲醇的存在可能導(dǎo)致酶催化活力的下降。為了解決這個(gè)問(wèn)題，需要從反應(yīng)體系中除去甲醇，而極性有機(jī)溶劑如叔丁醇(lgP=0.8)已經(jīng)被用來(lái)消溶甲醇[9]。所以采用溶劑設(shè)計(jì)(solvent engineering)的方法[10]，選擇一種混合溶劑作為反應(yīng)介質(zhì)，這種混合溶劑由可以提供酶催化反應(yīng)所需適合微環(huán)境的非極性溶劑和可以消溶甲醇的極性溶劑組成，如由叔戊醇和異辛烷混合而成的溶劑。

表2表明，叔戊醇混合溶劑中L-抗壞血酸的轉(zhuǎn)化率＞叔丁醇混合溶劑中的轉(zhuǎn)化率＞丙酮混合溶劑中的轉(zhuǎn)化率。隨著混合溶劑中極性溶劑含量的增加，反應(yīng)轉(zhuǎn)化率也隨之提高。當(dāng)?shù)竭_(dá)一定值后又隨之降低，這可能是因?yàn)闃O性溶劑消溶甲醇的能力已經(jīng)達(dá)到極限，甲醇重新開(kāi)始影響酶催化活性。這一趨勢(shì)在不同混合溶劑體系中都是一致的。然而，在相同溶劑比例的情況下，同一溶劑中加入不同的極性溶劑并沒(méi)有使酯交換反應(yīng)產(chǎn)生相同的反應(yīng)轉(zhuǎn)化率。例如，在溶劑比例為3:7，丙酮和異辛烷的混合溶劑中反應(yīng)轉(zhuǎn)化率為17.8%，而異辛烷和叔戊醇的混合溶劑中轉(zhuǎn)化率為35.6%。這可能是由于不同的極性溶劑對(duì)甲醇的消溶能力不同。

表2 在不同混合溶劑介質(zhì)中酶催化L-抗壞血酸與豬油甲酯的酯交換反應(yīng)Table 2 Effect of reaction medium polarity on the conversion ratio of L-ascorbic acid

2.3 酶量對(duì)L-抗壞血酸轉(zhuǎn)化率的影響

在酶催化反應(yīng)中，酶量對(duì)于反應(yīng)進(jìn)程的快慢有著決定性影響。在本實(shí)驗(yàn)中，脂肪酶固體顆粒直接懸浮于有機(jī)溶劑中，酶的加入量對(duì)于反應(yīng)進(jìn)行的程度有相當(dāng)大的影響。酶量上升增加接觸面積，促使酶促反應(yīng)加快，縮短反應(yīng)時(shí)間。隨著反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)酶活性降低，增大酶量保證反應(yīng)能最大化。酶量對(duì)于L-抗壞血酸轉(zhuǎn)化率的影響見(jiàn)圖3。

圖3 酶量對(duì)L-抗壞血酸轉(zhuǎn)化率的影響Fig.3 Effect of enzyme amount on the conversion ratio of L-ascorbic acid

從圖3可知，在反應(yīng)體系中，當(dāng)酶量為5%時(shí)，L-抗壞血酸轉(zhuǎn)化率比較低，但是隨著酶量的繼續(xù)增大，L-

抗壞血酸轉(zhuǎn)化率明顯提高，當(dāng)酶量超過(guò)15%時(shí)L-抗壞血酸轉(zhuǎn)化率變化逐漸趨于穩(wěn)定。不斷提高反應(yīng)體系中的酶量可以加快酯交換反應(yīng)的進(jìn)程，但與此同時(shí)逆反應(yīng)進(jìn)程也相應(yīng)加快。另外，過(guò)高的酶量還會(huì)帶入體系過(guò)多的水分，增加水解副反應(yīng)的發(fā)生。因此，過(guò)高的酶量并不一定有利于產(chǎn)物產(chǎn)量的提高，而應(yīng)該從各個(gè)方面考慮來(lái)選擇合適的酶量。

2.4 底物比率對(duì)L-抗壞血酸轉(zhuǎn)化率的影響

脂肪酶催化的L-抗壞血酸和復(fù)合豬油甲酯的酯交換反應(yīng)生是一種可逆反應(yīng)。反應(yīng)物過(guò)量或者在反應(yīng)中不斷除去某反應(yīng)產(chǎn)物，可使反應(yīng)向正方向進(jìn)行。當(dāng)L-抗壞血酸達(dá)到飽和時(shí)，溶劑中存在的過(guò)量的沒(méi)有溶解的L-抗壞血酸會(huì)阻礙傳質(zhì)，使L-抗壞血酸轉(zhuǎn)化率降低，造成L-抗壞血酸的浪費(fèi)[11]。同時(shí)由于L-抗壞血酸易氧化和發(fā)生其他副反應(yīng)，用量過(guò)多也會(huì)引起副反應(yīng)的增加。

圖4 底物物質(zhì)的量比對(duì)L-抗壞血酸轉(zhuǎn)化率的影響Fig.4 Effect of L-ascorbic acid/lard methyl ester molar ratio on the conversion ratio of L-ascorbic acid

保持L-抗壞血酸的量不變(0.1mmol/L)，改變復(fù)合豬油甲酯的量(0.2～1.4mmol/L)，以最佳的底物比率獲得最大L-抗壞血酸轉(zhuǎn)化率。由圖4可以看出，隨著底物含量的提高，L-抗壞血酸的轉(zhuǎn)化率也在增加，當(dāng)?shù)孜锉嚷市∮?0時(shí)，轉(zhuǎn)化率升高較快。隨著底物比率的繼續(xù)提高，L-抗壞血酸的轉(zhuǎn)化率并沒(méi)有表現(xiàn)出明顯的提高。原因可能有以下幾個(gè)方面：在比較高的底物比率下，所有酶分子己經(jīng)有效地與底物結(jié)合，酶已經(jīng)飽和，即使進(jìn)一步加入底物，提高底物比率對(duì)酶的催化速度也不再有影響[12]；高濃度的復(fù)合豬油甲酯不能完全溶入混和溶劑體系，提高了反應(yīng)體系的黏度，增加了反應(yīng)體系的傳質(zhì)阻力；酶活降低或酶部分失活，這主要是由于復(fù)合豬油甲酯中可能含有未處理干凈的游離脂肪酸，而高濃度的游離酸使酶分子周?chē)嗨峄蚴姑副韺咏Y(jié)合水被剝奪，使酶催化微環(huán)境或酶的空間構(gòu)象發(fā)生改變[13]。

2.5 反應(yīng)時(shí)間對(duì)L-抗壞血酸轉(zhuǎn)化率的影響

反應(yīng)時(shí)間對(duì)L-抗壞血酸轉(zhuǎn)化率也是一個(gè)重要的影響因素。通過(guò)不同反應(yīng)時(shí)間2、4、6、12、24、36、48h對(duì)脂肪酶Novozyme 435催化活性的變化情況，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 反應(yīng)時(shí)間對(duì)L-抗壞血酸轉(zhuǎn)化率的影響Fig.5 Effect of reaction time on the conversion ratio of L-ascorbic acid

由圖5可以看出，開(kāi)始反應(yīng)的前24h內(nèi)，雖然L-抗壞血酸轉(zhuǎn)化率都比較低，但是變化非常明顯，即酶促反應(yīng)速度非?？臁．?dāng)反應(yīng)進(jìn)行到2h時(shí)，L-抗壞血酸轉(zhuǎn)化率是13.6%，但當(dāng)反應(yīng)進(jìn)行到24h時(shí)，L-抗壞血酸轉(zhuǎn)化率已達(dá)到了51.3%，相當(dāng)于2h時(shí)的3.8倍。隨后，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，L-抗壞血酸轉(zhuǎn)化率變化不再明顯，呈現(xiàn)一種漸近趨勢(shì)。研究結(jié)果表明，反應(yīng)進(jìn)行到24h時(shí)已處于平衡狀態(tài)，繼續(xù)延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間對(duì)提高L-抗壞血酸轉(zhuǎn)化率己不再有意義。當(dāng)然，反應(yīng)到達(dá)平衡態(tài)所需時(shí)間的長(zhǎng)短還與反應(yīng)溫度有關(guān)。反應(yīng)溫度越高，酶催化速率越快，所需反應(yīng)時(shí)間就越短；反之，則越長(zhǎng)。

2.6 反應(yīng)溫度對(duì)L-抗壞血酸轉(zhuǎn)化率的影響

圖6 反應(yīng)溫度對(duì)L-抗壞血酸轉(zhuǎn)化率的影響Fig.6 Effect of reaction temperature on the conversion ratio of L-ascorbic acid

在有機(jī)溶劑中固定化酶具有較高的熱穩(wěn)定性，其在有機(jī)溶劑中的最適溫度比水中的要高，當(dāng)溫度升高時(shí)酶反應(yīng)的速度增加；但是當(dāng)溫度繼續(xù)升高，酶分子的變性失活速度也會(huì)增加。為確定復(fù)合豬油甲酯與L-抗壞血酸酯交換反應(yīng)中Novozyme 435的最佳溫度范圍，在45～80℃之間研究反應(yīng)溫度對(duì)L-抗壞血酸轉(zhuǎn)化率的影響，結(jié)果如圖6所示。

由圖6可以看出，在反應(yīng)體系中，當(dāng)反應(yīng)在45～65℃之間進(jìn)行時(shí)，L-抗壞血酸轉(zhuǎn)化率轉(zhuǎn)化率沒(méi)有明顯改變，但當(dāng)反應(yīng)溫度高于65℃時(shí)，轉(zhuǎn)化率明顯降低。這種現(xiàn)象可以通過(guò)化學(xué)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)Arrehenius方程來(lái)解釋?zhuān)?/p>

式中：K為酶反應(yīng)速率常數(shù)；A為阿侖尼烏斯常數(shù)；E為酶催化反應(yīng)所需活化能；T為反應(yīng)溫度；R為氣體常數(shù)。由方程可以看出，隨著反應(yīng)溫度的升高，酶催化反應(yīng)速率加快。同時(shí)這一方程也可以用來(lái)描述酶失活動(dòng)力學(xué)，失活速率常數(shù)可表示為公式：

式中：Kd為酶動(dòng)力學(xué)失活速率常數(shù)；Ad為阿侖尼烏斯常數(shù)；Ed為酶失活反應(yīng)活化能；T為反應(yīng)溫度；R為氣體常數(shù)。公式表明，隨著反應(yīng)溫度的升高，酶失活速率也加快。

對(duì)于本研究而言，由于溫度對(duì)L-抗壞血酸的穩(wěn)定性影響較大，要避免過(guò)高反應(yīng)溫度，故選擇比較低的55℃作為反應(yīng)體系中的最適反應(yīng)溫度。

2.7 酶的穩(wěn)定性

固定化酶的使用壽命是決定工業(yè)化過(guò)程生產(chǎn)成本的一個(gè)重要影響因素。在最佳條件下，使用Novozyme 435連續(xù)反應(yīng)9個(gè)批次，結(jié)果如圖7所示。

圖7 酶的穩(wěn)定性Fig.7 Effect of repeated use of Novozyme 435 lipase on the conversion ratio of L-ascorbic acid

從圖7可以看出，連續(xù)反應(yīng)9個(gè)批次后轉(zhuǎn)化率仍可達(dá)到47%以上，說(shuō)明該固定化酶在此反應(yīng)體系中穩(wěn)定，可以通過(guò)多次使用來(lái)降低成本。

3 討論與結(jié)論

目前國(guó)內(nèi)外生產(chǎn)的L-抗壞血酸脂肪酸酯產(chǎn)品主要是化學(xué)合成的L-抗壞血酸棕櫚酸酯。由于酶法生產(chǎn)L-抗壞血酸脂肪酸酯具有反應(yīng)條件溫和、環(huán)境污染小、選擇性高等諸多優(yōu)點(diǎn)，已成為研究的熱點(diǎn)之一。湯魯宏等[14]以脂肪酶Novozyme 435為催化劑，叔戊醇為介質(zhì)，在轉(zhuǎn)速200r/min、溫度55℃、水分含量0、酶量12.5%的條件下催化L-抗壞血酸和棕櫚酸或棕櫚酸甲酯合成了L-抗壞血酸棕櫚酸酯；孫燕等[15]在底物棕櫚酸甲酯與L-抗壞血酸的摩爾比1.3:1.0、反應(yīng)溫度36℃、反應(yīng)時(shí)間24h、脂肪酶濃度15%、含水量1%的條件下，以黑曲霉脂肪酶為催化劑獲得VC的轉(zhuǎn)化率為23%。Humeau等[4]以棕櫚酸為反應(yīng)底物，在叔戊醇反應(yīng)體系中使用Novozyme 435催化合成了L-抗壞血酸棕櫚酸酯，反應(yīng)轉(zhuǎn)化率為68%；Song等[16]以亞油酸為底物催化合成了L-抗壞血酸亞油酸酯，反應(yīng)轉(zhuǎn)化率為33.5%；Chang等[17]采用RSM優(yōu)化的方法，以月桂酸為反應(yīng)底物，得到了高達(dá)93%的底物轉(zhuǎn)化率。以上所有的研究報(bào)道都集中于利用脂肪酶催化L-抗壞血酸與脂肪酸或脂肪酸甲酯/乙酯直接酯化或轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)合成L-抗壞血酸脂肪酸酯，都是采用單一脂肪酸或其甲酯/乙酯作為底物來(lái)源，而這些物質(zhì)的價(jià)格都比較高，尤其是多不飽和脂肪酸。

與已報(bào)道的研究相比，本研究采用天然動(dòng)物油脂——豬油首先得到復(fù)合豬油甲酯，然后利用脂肪酶催化反應(yīng)合成L-抗壞血酸脂肪酸酯，并采用溶劑設(shè)計(jì)的方法解決了反應(yīng)副產(chǎn)物甲醇對(duì)脂肪酶催化活性的抑制，得到了較高的L-抗壞血酸轉(zhuǎn)化率。最佳反應(yīng)條件是固定化酶Novozyme 435作為催化劑、反應(yīng)介質(zhì)為30%叔戊醇:70%異辛烷、酶用量10%、底物L(fēng)-抗壞血酸與復(fù)合豬油甲酯的摩爾比1:10、反應(yīng)溫度55℃、反應(yīng)時(shí)間24h。在此條件下，轉(zhuǎn)化率可達(dá)到(52.7±2.8)%，與Humeau等[4]研究結(jié)果相近。由于豬油含有多種不飽和脂肪酸，其中油酸含量為43.2%，不穩(wěn)定的雙鍵結(jié)構(gòu)可能會(huì)對(duì)酶的催化產(chǎn)生不利的影響，降低了底物轉(zhuǎn)化率。這一現(xiàn)象與Song等[16]的報(bào)道相符，其原因還有待于進(jìn)一步研究。

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Lipase-catalytic Synthesis of L-Ascorbyl Fatty Acid Esters in Mixed Organic Media

A novel way for the synthesis of L-ascorbyl fatty acid esters (AFAE) from low-cost lard and L-ascorbic acid under the catalysis of lipase was developed and the optimal reaction conditions were investigated. It was found that a higher substrate conversion ratio was obtained in single organic solvents than in their pairwise combinations and the optimal solvent system consisted of t-pentanol and isooctane (30:70, V/V). The optimal reaction conditions for maximum substrate conversion ratio were as follows: L-ascorbic acid/lard methyl ester molar ratio 1:10; enzyme amount 10%; and reaction temperature 55 ℃ for a reaction duration of 24 h. The conversion ratio of L-ascorbic acid under these reaction conditions reached up to (52.7±2.8)%.

lipase；lard；enzymatic synthesis；L-ascorbyl fatty acid esters

TS201.1；TQ466.3

A

1002-6630(2010)18-0134-05

2010-05-11

國(guó)家“863”計(jì)劃項(xiàng)目(2007AA100401；2008AA10Z309)；江蘇省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(BE2008308)

張宇(1983—)，男，碩士研究生，主要從事食品生物技術(shù)研究。E-mail：zhangyu1983323@yahoo.cn

*通信作者：呂鳳霞(1963—)，女，副教授，博士，主要從事酶工程研究。E-mail：lufengxia@163.com