楊志剛，沈宗根，張燕萍

(常熟理工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，江蘇 常熟 215500)

苦瓜皂苷對(duì)成骨細(xì)胞增殖和ALP的影響

楊志剛，沈宗根，張燕萍

(常熟理工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，江蘇 常熟 215500)

研究苦瓜皂苷對(duì)體外培養(yǎng)的新生SD 乳鼠成骨細(xì)胞增殖和ALP的影響。以1×10-8～1×10-4mol/L濃度梯度的苦瓜皂苷的MEM含藥培養(yǎng)液對(duì)新生 SD乳鼠24h內(nèi)顱蓋骨進(jìn)行體外細(xì)胞培養(yǎng)，分別用 MTT法和 PNPP法檢測(cè)成骨細(xì)胞的增殖和堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性。結(jié)果表明：苦瓜皂苷具有時(shí)間和劑量依賴(lài)性地促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖和提高成骨細(xì)胞 ALP活性。

苦瓜皂苷；成骨細(xì)胞；ALP

苦瓜(Mo mord ica charanti a L.)是葫蘆科(Cucurbitaceae)苦瓜屬植物，又稱(chēng)癩葡萄和錦荔枝，屬蔓性一年生蔬菜?！侗静菥V目》記載：苦瓜“苦寒、無(wú)毒、除邪熱、解勞乏、清心明目、益氣壯陽(yáng)”。皂苷是苦瓜中的主要活性成分?；瘜W(xué)研究表明，苦瓜皂苷主要屬于四環(huán)三萜類(lèi)葫蘆素烷型皂苷，由皂苷元和低聚糖構(gòu)成，具有降血糖、抗氧化、提高免疫能力、提高雌激素水平、抗腫瘤、抗艾滋病毒等生理功能[1-5]。近期研究表明苦瓜皂苷具有防治骨質(zhì)疏松癥的藥理作用[6]，為研究其作用機(jī)理，本實(shí)驗(yàn)利用體外成骨細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)觀察苦瓜皂苷對(duì)成骨細(xì)胞增殖和堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

新生SD乳鼠，清潔級(jí)，蘇州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(蘇)2007-0007，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(蘇)2007-0035。

苦瓜皂苷(粉末，純度98%) 南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司；VD3上海通用藥業(yè)股份有限公司；新生牛血清(NCS)、MEM培養(yǎng)基 Invitrogen 公司；胰酶、Ⅱ型膠原酶、二甲基亞砜(D M S O)、四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT) Sigma公司；ALP試劑盒、TritonX-100 南京建成生物技術(shù)公司。

CO2培養(yǎng)箱 Shellab公司；倒置相差顯微鏡 Nikon公司；UV-2450紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 島津公司；酶標(biāo)儀 Thermo 公司；培養(yǎng)板 Costar公司。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組

苦瓜皂苷和VD3分別溶于DMSO中，用對(duì)比稀釋法配制成含12%小牛血清的MEM含藥培養(yǎng)液，藥物終含量分別為：溶媒對(duì)照中DMSO 0.01%；苦瓜皂苷組中皂苷含量分別為1×10-8、 1×10-7、1×10-6、1×10-5、1×10-4mol/L；VD3組中VD3含量為1×10-6mol/L。

1.2.2 成骨細(xì)胞分離與培養(yǎng)[7-8]

取新生 SD乳鼠 5只(24h內(nèi))，75%酒精浸泡 5min，無(wú)菌取顱蓋骨，置 D-hanks液中，剔除干凈黏附的結(jié)締組織和血管，D-hanks液再次沖洗，放入小瓶中剪碎約1mm3，將骨片移入5mL 0.25%胰蛋白酶溶液，37℃預(yù)消化25min，將骨片移入5mL 0.1% II型膠原酶溶液中消化，37℃水浴振蕩，60次/min，45min×2次，將含細(xì)胞的消化液1000r/min離心10min，棄上清液，PBS清洗，加入含12%小牛血清的MEM培養(yǎng)液，將沉淀的細(xì)胞團(tuán)塊用培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，混勻計(jì)數(shù)，按需要密度接種于培養(yǎng)瓶，置5% CO2培養(yǎng)箱37℃孵育，48h后換液，2～3d換液 1次，貼壁率達(dá) 80%～90%及時(shí)傳代。

1.2.3 成骨細(xì)胞傳代

原代細(xì)胞培養(yǎng)液加4mL D-Hanks液，漂洗，棄液，加2.5mL 0.25%的胰蛋白酶消化，約4min左右，肉眼觀察薄膜現(xiàn)象，相差倒置顯微鏡觀察細(xì)胞間隙變大回縮時(shí)棄胰酶消化液，加入6mL含12%小牛血清的MEM培養(yǎng)液，吹打細(xì)胞層呈片狀從瓶壁脫落，相差倒置顯微鏡觀察細(xì)胞變圓，按1:3瓶比例傳代，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.2.4 MTT法測(cè)定成骨細(xì)胞增殖

參照文獻(xiàn)[9]記錄方法，采用第2代成骨細(xì)胞消化后制成1×105個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，96孔培養(yǎng)板每孔100μL培養(yǎng)，24h后棄原培養(yǎng)液，按1.2.1節(jié)方法分組，分別加含不同藥液血清培養(yǎng)液100μL，放置5% CO2培養(yǎng)箱37℃繼續(xù)培養(yǎng)，分別在24、48、72h結(jié)束前4h PBS沖洗，更換無(wú)血清的MEM培養(yǎng)液，同時(shí)加入5mg/mL MTT溶液10μL孵育4h，棄上清液，加100μL酸化的10% SDS過(guò)夜，酶標(biāo)儀570nm波長(zhǎng)處比色檢測(cè)細(xì)胞增殖OD值。

1.2.5 KAPLOW氏法觀察成骨細(xì)胞分化

參照文獻(xiàn)[10]記錄方法，選用第2代成骨細(xì)胞消化后制成1×105個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，以2mL細(xì)胞懸液接種于6孔培養(yǎng)板，24h后換液。將含12%小牛血清含藥MEM培養(yǎng)液分別加入內(nèi)置有蓋玻片的6孔板內(nèi)。含藥培養(yǎng)液的藥物終含量分別為：溶媒對(duì)照組DMSO 0.01%、苦瓜皂苷組1×10-4mol/L、VD3組1×10-6mol/L，2d換含藥培養(yǎng)液一次，放置5% CO2培養(yǎng)箱37℃繼續(xù)培養(yǎng)，6d后進(jìn)行ALP染色，100倍倒置顯微鏡觀察。

1.2.6 PNPP法測(cè)定成骨細(xì)胞ALP活性

參照文獻(xiàn)[10] 記錄方法，選用第2代成骨細(xì)胞消化后制成1×105個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，24孔培養(yǎng)板每孔1mL培養(yǎng)，24h后棄原培養(yǎng)液，按1.2.1方法分組分別加含不同藥液血清培養(yǎng)液1mL，放置5% CO2培養(yǎng)箱37℃繼續(xù)培養(yǎng)，分別于2、3、6d后取出，PBS沖洗，每孔加0.25mL 0.1%的Triton-100溶解細(xì)胞膜，10min后按ALP測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行ALP比活性測(cè)定。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 成骨細(xì)胞鑒定

培養(yǎng)第1天可見(jiàn)細(xì)胞數(shù)量較多懸浮在培養(yǎng)液中，呈圓形，核大而圓位于胞體的一端；24h后細(xì)胞全部貼壁，胞體展開(kāi)呈三角形、多角形、梭形等，核呈卵圓形；對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞分裂相多見(jiàn)，有較多的突起互相連接；細(xì)胞匯合時(shí)呈鋪石狀，并可重疊生長(zhǎng)，符合成骨細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征。堿性磷酸酶染色，酶活動(dòng)處呈亮紅顆粒，ALP測(cè)定培養(yǎng)液有較高的ALP活性，符合成骨細(xì)胞功能學(xué)特征。

2.2 苦瓜皂苷對(duì)成骨細(xì)胞增殖的影響

表1 苦瓜皂苷對(duì)新生大鼠顱蓋骨成骨細(xì)胞增殖的影響(±s，n=5)Table 1 Effect of treatment withMomordica charantiaL. saponins for different hours on the proliferation ofin vitrocultivated osteoblasts in neonatal rat calvaria (±s，n=5)

表1 苦瓜皂苷對(duì)新生大鼠顱蓋骨成骨細(xì)胞增殖的影響(±s，n=5)Table 1 Effect of treatment withMomordica charantiaL. saponins for different hours on the proliferation ofin vitrocultivated osteoblasts in neonatal rat calvaria (±s，n=5)

注：*.與溶媒對(duì)照組相比，有顯著性差異(P＜0.05)；**.與溶媒對(duì)照組相比，有極顯著性差異(P＜0.01)。

藥物濃度/(mol/L)OD570nm24h48h72h溶媒對(duì)照組0.103±0.0180.189±0.0180.218±0.045 1×10-80.105±0.0190.190±0.0160.320±0.048 1×10-70.124±0.0290.195±0.0140.322±0.054苦瓜皂苷組1×10-60.131±0.0270.205±0.0200.364±0.118* 1×10-50.146±0.0380.241±0.039*0.372±0.065** 1×10-40.152±0.022*0.261±0.025**0.395±0.098** VD3組1×10-60.203±0.032**0.268±0.045**0.347±0.058**

由表1可見(jiàn)，苦瓜皂苷作用24h后，1×10-4mol/L濃度組對(duì)培養(yǎng)成骨細(xì)胞具有促增殖作用，與溶媒對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。作用48h后，1×10-5mol/L和1×10-4mol/L 濃度組促增殖作用較為明顯，與溶媒對(duì)照組比較有顯著差異(P＜0.05 或P＜0.01)。作用72h后，在1×10-6～1×10-4mol/L濃度范圍內(nèi)對(duì)培養(yǎng)成骨細(xì)胞均表現(xiàn)出促增殖作用，與溶媒對(duì)照組比較，苦瓜皂苷對(duì)成骨細(xì)胞的增殖作用具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05 或P＜0.01)。

2.3 苦瓜皂苷對(duì)成骨細(xì)胞ALP的影響

由圖1 KAPLOW氏法染色細(xì)胞圖片可見(jiàn)，與未染色組比較，溶媒對(duì)照組成骨細(xì)胞經(jīng)ALP染色后可見(jiàn)有紅色，但偶見(jiàn)紅色顆粒；經(jīng)苦瓜皂苷作用后，成骨細(xì)胞ALP染色呈片狀的紅色，且有較多的紅棕色顆粒著色；VD3組成骨細(xì)胞，經(jīng)ALP染色后呈彌散的紅色，也有一定的紅棕色顆粒著色。

圖1 新生大鼠顱蓋骨成骨細(xì)胞KAPLOW氏法染色細(xì)胞涂片(×100)Fig.1 KAPLOW staining observations of rat osteoblasts treated and untreated withMomordica charantiaL. saponins (×100)

表2 苦瓜皂苷對(duì)新生大鼠顱蓋骨成骨細(xì)胞ALP活性的影響(±s，n=3)Table 2 Effect of treatment withMomordica charantiaL. saponins for different hours on ALP activity ofin vitrocultivated osteoblasts in neonatal rat calvaria (±s，n=3)

表2 苦瓜皂苷對(duì)新生大鼠顱蓋骨成骨細(xì)胞ALP活性的影響(±s，n=3)Table 2 Effect of treatment withMomordica charantiaL. saponins for different hours on ALP activity ofin vitrocultivated osteoblasts in neonatal rat calvaria (±s，n=3)

注：*.與溶媒對(duì)照組相比，有顯著性差異(P＜0.05)；**.與溶媒對(duì)照組相比，有極顯著性差異(P＜0.01)。

藥物濃度/(mol/L)成骨細(xì)胞ALP活性2d3d6d溶媒對(duì)照組0.143±0.0380.149±0.0280.178±0.034 1×10-80.175±0.0390.169±0.0320.203±0.043 1×10-70.194±0.0280.204±0.0440.312±0.105*苦瓜皂苷組1×10-60.235±0.0470.297±0.065*0.323±0.78** 1×10-50.279±0.048*0.334±0.049**0.389±0.053** 1×10-40.325±0.052**0.351±0.085**0.487±0.071** VD3組1×10-60.287±0.053**0.329±0.055**0.347±0.068**

由表2 PNPP法定量分析結(jié)果可見(jiàn)，新生大鼠顱蓋骨成骨細(xì)胞在苦瓜皂苷培養(yǎng)條件下，其分泌的ALP活性隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增強(qiáng)。苦瓜皂苷作用2d后，在1×10-5～1×10-4mol/L 濃度范圍內(nèi)培養(yǎng)的成骨細(xì)胞，與溶媒對(duì)照組比較，其ALP活性增強(qiáng)(P＜0.05或P＜0.01)。作用3d后，以1×10-6、1×10-5、1×10-4mol/L濃度培養(yǎng)成骨細(xì)胞，與溶媒對(duì)照組比較，其ALP活性增加明顯(P＜0.05 或P＜ 0.01)。作用6d后，苦瓜皂苷各組ALP活性升高明顯，尤以1×10-7、1×10-6、1×10-5、1× 10-4mol/L 濃度范圍培養(yǎng)的成骨細(xì)胞作用更顯著，與溶媒對(duì)照組比較呈現(xiàn)顯著的促進(jìn)作用(P＜0.05 或P＜0.01)。

3 結(jié) 論

3.1 成骨細(xì)胞具有合成、分泌組成骨基質(zhì)的膠原和糖蛋白的作用，在維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，生理機(jī)制調(diào)節(jié)和骨代謝疾病中發(fā)揮主要作用。目前，評(píng)定促進(jìn)骨細(xì)胞功能藥物的主要藥效指標(biāo)有骨細(xì)胞增殖評(píng)定，ALP測(cè)定等。MTT比色法是由Mosman建立的一種快速測(cè)定細(xì)胞增殖的方法，能反映細(xì)胞內(nèi)的DNA合成狀態(tài)[11]。本研究MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，苦瓜皂苷在1×10-4mol/L濃度培養(yǎng)成骨細(xì)胞24h，與溶媒對(duì)照組比較具有促細(xì)胞增殖作用，作用時(shí)間延長(zhǎng)至48h和72h促增殖作用更明顯，表明苦瓜皂苷對(duì)成骨細(xì)胞具有促增殖作用，且具有時(shí)間和劑量依賴(lài)性。

3.2 新生大鼠顱蓋骨成骨細(xì)胞經(jīng)ALP重氮鹽法(改良KAPLOW氏法)染色后，鏡下成骨細(xì)胞呈現(xiàn)紅色著色，與未染色成骨細(xì)胞鏡下所見(jiàn)差異明顯，表明所培養(yǎng)的細(xì)胞確為成骨細(xì)胞。ALP是成骨細(xì)胞所分泌的一種酶蛋白，特異性高，為成骨細(xì)胞分化成熟的主要標(biāo)志之一。ALP在細(xì)胞中表達(dá)的多少，能合理地反映成骨細(xì)胞的分化程度和功能狀態(tài)，當(dāng)成骨細(xì)胞活動(dòng)增強(qiáng)時(shí)，ALP活性升高，ALP活性的高表達(dá)是成骨細(xì)胞分化成熟的早期標(biāo)志。本研究顯示，與溶媒對(duì)照組相比較，苦瓜皂苷組新生大鼠顱蓋骨成骨細(xì)胞經(jīng)ALP重氮鹽法(改良KAPLOW氏法)染色后，ALP染色呈片狀的紅色，且有較多的紅棕色顆粒著色，表明苦瓜皂苷具有促進(jìn)成骨細(xì)胞分泌ALP的功能，進(jìn)一步的定量研究結(jié)果表明苦瓜皂苷具有時(shí)間和劑量依賴(lài)性地增加成骨細(xì)胞分泌ALP的作用。

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Effect of Momordica charantia L. Saponins on Osteoblast Proliferation and Alkaline Phosphatase Expression

YANG Zhi-gang，SHEN Zong-gen，ZHANG Yan-ping
(College of Biology and Food Engineering, Changshu Institute of Technology, Changshu 215500, China)

The present study was aimed at investigating the effect of Momordica charantia L. saponins on the proliferation and alkaline phosphatase (ALP) expression of in vitro cultivated osteoblasts of new born neonatal SD rats. The in vitro cultivation of new born SD rat (aged within 24 h) osteoblast at gradient concentrations of Momordica charantia L. saponins in MEM medium was performed, and MTT and PNPP assays were used to measure the proliferation and ALP activity of osteoblasts, respectively. Our findings suggest that Momordica charantia L. saponins promote the proliferation and ALP activity of osteoblasts in timeand dose-dependent manners.

Momordica charantia L. saponins；osteoblast；ALP

R965 ；Q946.83

A

1002-6630(2010)23-0383-03

2010-11-23

常熟理工學(xué)院青年教師科研啟動(dòng)基金項(xiàng)目(QZ0811)

楊志剛(1977—)，男，實(shí)驗(yàn)師，碩士，主要從事藥用植物活性成分藥理研究。E-mail：zgy@cslg.cn