張鳳清

(長(zhǎng)春工業(yè)大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130012)

復(fù)方紫草抗氧化劑的毒性初步評(píng)價(jià)

張鳳清

(長(zhǎng)春工業(yè)大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130012)

以乙醇提取法獲得紫草提取物(Z)和甘草提取物(G)，以堿提酸沉法獲得槐米提取物(H)，再輔以檸檬酸(N)和VE(E)，按Z:G:H:N:E為10:5:5:2:1的比例復(fù)配成復(fù)方紫草抗氧化劑(FZK)。以FZK為受試物，通過(guò)小鼠經(jīng)口急性毒性實(shí)驗(yàn)、小鼠骨髓細(xì)胞微核實(shí)驗(yàn)、小鼠骨髓細(xì)胞染色體畸變實(shí)驗(yàn)等毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)對(duì)FZK的毒性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。結(jié)果表明：小鼠經(jīng)口最大耐受劑量均大于16000mg/kg bw，F(xiàn)ZK急性毒性分級(jí)為無(wú)毒級(jí)。劑量小于8000mg/kg bw條件下，F(xiàn)ZK對(duì)小鼠嗜多染紅細(xì)胞微核率無(wú)促提高作用，對(duì)小鼠骨髓細(xì)胞染色體無(wú)致畸作用。該食品添加劑不存在致突變性。

紫草；甘草；槐米；毒理學(xué)；安全

紫草、甘草、槐米是我國(guó)傳統(tǒng)中藥，甘草、槐米被我國(guó)列為藥食兼用植物和天然食品抗氧化劑，紫草提取物紫草素被我國(guó)列為天然食品著色劑[1]。紫草素屬于萘醌類化合物，分子結(jié)構(gòu)上含有對(duì)位酚羥基，甘草的化學(xué)成分中含有甘草苷等100多種黃酮類化合物，槐米的主要化學(xué)成分是蘆丁，紫草、甘草、槐米、V E因酚羥基的存在而表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化能力[2-4]。甘草和紫草還有較強(qiáng)的抗菌活性[2]。 前期實(shí)驗(yàn)利用正交試驗(yàn)對(duì)復(fù)方紫草抗氧化劑(FZK)的配方進(jìn)行了優(yōu)選，對(duì)FZK的抗氧化性能、抑菌效果進(jìn)行了表征，結(jié)果表明，該抗氧化抑菌劑完全可以作為天然功能型食品添加劑而開發(fā)應(yīng)用[5-6]。

國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì)紫草、甘草及其提取物的毒性進(jìn)行了初步研究[7-13]，有學(xué)者報(bào)道了新疆軟紫草的乙醇提取物對(duì)昆明種小鼠的最大耐受劑量為19.5g/kg bw，但是中藥紫草的水煎物以1.0g/kg bw劑量作用于小鼠時(shí)，具有潛在遺傳毒性。將甘草提取物加入到潤(rùn)喉糖中，未見(jiàn)有致突變作用。甘草與麥冬和三參對(duì)哺乳動(dòng)物遺傳物質(zhì)不具有損傷效應(yīng)。但是，作為傳統(tǒng)中藥來(lái)說(shuō)其低毒、無(wú)毒是相對(duì)的，從毒理學(xué)方面來(lái)考慮，從這些植物中提取有效成分并配伍使用已不同傳統(tǒng)意義上的單味中藥。國(guó)內(nèi)外對(duì)紫草、甘草、槐米的混合提取物進(jìn)行毒性評(píng)價(jià)未見(jiàn)報(bào)道。所以將這些提取物復(fù)配并作為食品抗氧保鮮劑來(lái)使用時(shí)，對(duì)其進(jìn)行毒理學(xué)安全性評(píng)價(jià)具有重要意義。本研究進(jìn)行急性毒性實(shí)驗(yàn)、小鼠骨髓細(xì)胞微核實(shí)驗(yàn)、小鼠骨髓細(xì)胞染色體畸變實(shí)驗(yàn)等毒性實(shí)驗(yàn)研究，以考察FZK中各混合物交互作用的安全性。同時(shí)，為下階段亞慢性毒性實(shí)驗(yàn)和慢性毒性實(shí)驗(yàn)的染毒途徑和劑量

選擇提供依據(jù)。研究為復(fù)方紫草抗氧化劑的開發(fā)應(yīng)用提供毒理學(xué)方面科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

ICR小鼠，SPF級(jí)，體質(zhì)量(20±2)g，來(lái)自吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飲水為自來(lái)水，灌胃前動(dòng)物禁食14h。

紫草、甘草、槐米購(gòu)自北京同仁堂長(zhǎng)春市分店。由長(zhǎng)春市藥品檢驗(yàn)所鑒定為合格原料藥。其中紫草產(chǎn)自新疆，甘草產(chǎn)自內(nèi)蒙古，槐米產(chǎn)自山東，三種藥材均為道地藥材。

注射用環(huán)磷酰胺(0.2g/支) 山西普德藥業(yè)有限公司； 羧甲基纖維素鈉(分析純) 河南省華發(fā)科技有限責(zé)任公司；小牛血清(100mL/瓶) 上海銳聰科技發(fā)展有限公司；秋水仙素(1g/瓶) Sigma公司。

CHK-B145生物顯微鏡 日本Olympus 公司；TDZ5-WS離心機(jī) 湖南賽特湘儀離心機(jī)儀器有限公司；DK-98-I恒溫水浴鍋 天津泰斯特儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 FZK提取工藝

紫草素提取工藝：紫草根→粉碎(過(guò)40目篩)→乙醇回流浸提→抽濾→濾渣回流提取2次→合并濾液→旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮(加入溶液體積1/3的 2g/100mL NaOH溶液使提取液由紫紅色變?yōu)樗{(lán)色)→過(guò)濾→濾液(加濃鹽酸至不再產(chǎn)生沉淀)→過(guò)濾→沉淀(水洗至中性，60℃以下干燥)→紫草素粗品。

紫草素乙醇提取條件：乙醇體積分?jǐn)?shù)：75%；溫度：80℃；熱回流時(shí)間：40min；料液比：1:6(m/V)。

甘草苷提取工藝：甘草→粉碎(過(guò)40目篩)→乙醇回流浸提→抽濾→濾渣回流提取2次→合并濾液→旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮→噴霧干燥→甘草苷粗品。

甘草苷乙醇提取條件：乙醇體積分?jǐn)?shù)：75%；溫度：60℃；熱回流時(shí)間：60min；料液比：1:10(m/V)。

蘆丁提取工藝：槐米→粉碎(過(guò)40目篩)→水煮→抽濾→濾渣重復(fù)提取2次→合并濾液→調(diào)pH值→靜置→抽濾→水洗、干燥→蘆丁粗品。

水煎煮條件：6倍水、硼砂適量，煮沸加石灰乳至pH8～9，微沸30min。調(diào)pH值：60～70℃下，用濃度為12mol/L的鹽酸調(diào)pH5左右。水洗至中性，60℃干燥。

1.2.2 FZK的配制

將紫草提取物、甘草提取物、槐米提取物作為FZK的主料并按2:1:1的比例混合，檸檬酸和VE作為FZK的輔料并按2:1混合，分別稱取主料混合物200g和輔料30g并混合均勻，加入適量70%乙醇稀釋，噴霧干燥。工藝參數(shù)：進(jìn)風(fēng)溫度：115～140℃，出風(fēng)溫度：90℃左右，風(fēng)機(jī)轉(zhuǎn)數(shù)：1400r/min，工作壓力：0.23～0.25MPa。

1.2.3 急性毒性實(shí)驗(yàn)[14]

因?yàn)槭茉囄颋ZK不溶于水，采用2g/100mL甲基纖維素鈉溶液作為分散劑，預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明動(dòng)物的接受劑量超過(guò)15000mg/kg bw，因此檢測(cè)了FZK的最大耐受劑量。20只ICR小鼠，雌雄各10只，按最大受試物分散度，最大限量法灌胃2次，每次間隔2h，給藥劑量為每次16000mg/kg bw，給藥后雌雄分籠正常飼養(yǎng)。

1.2.4 小鼠骨髓細(xì)胞微核實(shí)驗(yàn)和骨髓細(xì)胞染色體畸變實(shí)驗(yàn)

1.2.4.1 分組及給藥劑量

小鼠骨髓細(xì)胞微核實(shí)驗(yàn)和骨髓細(xì)胞染色體畸變實(shí)驗(yàn)各ICR小鼠50只，分為5組，每組10只，雌雄各半。采用二次經(jīng)口灌胃給藥，每次間隔24h。由于未測(cè)出樣品的LD50，故按動(dòng)物最大耐受劑量的1/2、1/4、1/8分別設(shè)8000、4000、2000mg/kg bw 3個(gè)劑量組，另設(shè)陰性對(duì)照組和環(huán)磷酰胺陽(yáng)性對(duì)照組，陰性對(duì)照組給予同等容量的生理鹽水，陽(yáng)性對(duì)照組給予環(huán)磷酰胺400mg/kg bw。

1.2.4.2 小鼠骨髓細(xì)胞微核實(shí)驗(yàn)

末次給藥6h，脫頸處死動(dòng)物，取胸骨骨髓用小牛血清稀釋涂片，用Giemsa染色。

1.2.4.3 小鼠骨髓細(xì)胞染色體畸變實(shí)驗(yàn)

末次給藥24h，脫頸處死動(dòng)物。動(dòng)物處死前4h，腹腔注射秋水仙素(8mg/kg bw)。取股骨骨髓經(jīng)低滲、固定、滴片、Gi emsa染色。

1.2.5 指標(biāo)檢測(cè)

1.2.5.1 最大耐受劑量

染毒后觀察動(dòng)物的一般狀態(tài)、體質(zhì)量變化、中毒癥狀和死亡情況，觀察期限為14h。

1.2.5.2 小鼠骨髓細(xì)胞微核率

在光學(xué)顯微鏡下，每只動(dòng)物計(jì)數(shù)1000個(gè)嗜多染紅細(xì)胞(PCE)，微核率以含微核的嗜多染紅細(xì)胞千分率計(jì)。

1.2.5.3 染色體畸變百分率

在光學(xué)顯微鏡下，每只動(dòng)物觀察100個(gè)中期分裂相，計(jì)數(shù)染色體畸變百分率。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。用單因素方差分析ANOVA，以Duncans多重比較檢驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示，采用組間t檢驗(yàn)，P＜0.05時(shí)具有顯著性差異，P＞0.05時(shí)無(wú)顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 受試物對(duì)小鼠急性經(jīng)口急性毒性

灌胃后實(shí)驗(yàn)動(dòng)物活動(dòng)自如，狀態(tài)良好，飲食正常，未見(jiàn)異常表現(xiàn)與死亡。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 受試物對(duì)小鼠急性經(jīng)口毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 Acute toxicity test results of FZK in mice

由表1可見(jiàn)，雌、雄性小鼠對(duì)FGK經(jīng)口最大耐受劑量均大于16000mg/kg bw，F(xiàn)ZK的急性毒性分級(jí)為無(wú)毒級(jí)。

2.2 受試物對(duì)小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核率的影響

表2 小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核率的影響Table 2 Effect of FZK on micronucleus rate of bone marrow cells in mice

如表2所示，該受試物各劑量組小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核率未見(jiàn)明顯增加，與陰性對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異(P＞0.05)，而環(huán)磷酰胺陽(yáng)性對(duì)照組與劑量組比較，有非常顯著性差異(P＜0.05)，說(shuō)明該劑量條件下，受試物對(duì)小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核率無(wú)促提高作用。

2.3 受試物對(duì)小鼠骨髓細(xì)胞染色體畸變率的影響

表3 受試物對(duì)小鼠骨髓細(xì)胞染色體畸變率的影響Table 3 Effect of FZK on chromosomal aberration rate of bone marrow cells in mice

如表3所示，各劑量組、陰性對(duì)照組小鼠骨髓細(xì)胞染色體畸變細(xì)胞數(shù)與陽(yáng)性組比較，數(shù)量明顯降低，差異有顯著性(P＜0.05)。而各劑量組與陰性對(duì)照組比較以及各劑量組之間比較，差異無(wú)顯著性(P＞0.05)。表明該劑量條件下未見(jiàn)到受試物對(duì)小鼠骨髓細(xì)胞染色體的致畸作用。

3 討 論

本研究是以紫草提取物、甘草提取物、槐米提取物再輔以檸檬酸和V E而制備了復(fù)方紫草抗氧化劑(FZK)，并對(duì)其急性毒性和致突變性進(jìn)行研究。由于FZK的動(dòng)物可耐受劑量大，達(dá)到15000mg/kg bw 的劑量下實(shí)驗(yàn)動(dòng)物未出現(xiàn)死亡情況，因此，急性毒性實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)了最大耐受劑量。微核實(shí)驗(yàn)是70年代初期建立的一種利用哺乳動(dòng)物骨髓細(xì)胞染色體改變來(lái)測(cè)定致突變作用的實(shí)驗(yàn)方法。由于小鼠骨髓嗜多染性紅細(xì)胞(PCE)微核實(shí)驗(yàn)法具有簡(jiǎn)便快速等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于電離輻射、環(huán)境致突變劑等的研究。微核實(shí)驗(yàn)和染色體畸變實(shí)驗(yàn)?zāi)壳耙驯还J(rèn)為篩選致突變性的主要方法之一。環(huán)磷酰胺是一種烷化劑，可引起基因突變和染色體畸變，環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)DNA損傷可導(dǎo)致細(xì)胞周期混亂和特定細(xì)胞群體中的細(xì)胞死亡[15]，因此常用環(huán)磷酰胺作為致突變性實(shí)驗(yàn)的陽(yáng)性對(duì)照藥。

甘草提取物L(fēng)D50＞10g/kg bw(大鼠，經(jīng)口)，紫草LD50＞4.46g/kg bw(小鼠，經(jīng)口)。Amese實(shí)驗(yàn)、小鼠骨髓細(xì)胞微核實(shí)驗(yàn)、小鼠骨髓細(xì)胞染色體畸變實(shí)驗(yàn)，均未發(fā)現(xiàn)致突變作用[1]。表明這些中草藥及其提取物作為食品添加劑具有無(wú)毒、抗氧化、抑菌等優(yōu)點(diǎn)。本研究是以紫草提取物、甘草提取物、槐米提取物的混合物為受試物對(duì)象，急性毒性實(shí)驗(yàn)、遺傳毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果均未發(fā)現(xiàn)各種化合物交互作用毒性增強(qiáng)。

FZK作為這些中草藥的復(fù)方制劑小鼠經(jīng)口最大耐受劑量大于16000mg/kg bw，毒性分級(jí)為無(wú)毒級(jí)，小鼠在最高劑量(8000mg/kg bw)為人可能攝取量的20000倍情況下遺傳毒性實(shí)驗(yàn)未發(fā)生致突變現(xiàn)象。表明復(fù)方紫草抗氧化劑同樣具有較高的安全性，作為天然功能型食品添加劑有著廣闊的應(yīng)用前景。

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Preparation and Toxicity Evaluation of Compound Lithospermum Antioxidant

ZHANG Feng-qing
(School of Chemistry and Life Science, Changchun University of Technology, Changchun 130012, China)

A compound Lithospermum antioxidant (FZK) was prepared using Lithospermum ethanol extract (Z), licorice ethanol extract (G), Sophora japonica extraction (H) from alkali extraction and acid precipitation, citric acid (N) and vitamin E (E) by the ratio of 10:5:5:2:1 (Z:G:H:N:E). The toxicity of FZK was evaluated by acute toxicity test, micronucleus test of bone marrow cells in mice, and chromosomal aberration test of bone marrow cells. Results indicated that the maximum tolerance dose of oral administration in mice was 16000 mg/kg body weight. According to acute toxicity classification criteria, FZK is non-toxic. However, FZK didn, t exhibit a role in improving micronucleus rate of polychromatic erythrocyte and the mutagenicity in mice at the dose of less than 8000 mg/kg body weight.

Lithospermum；licorice；bud of Sophora japonica；toxicology；safe

TS202.3

A

1002-6630(2010)23-0380-03

2010-08-19

吉林省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(20065027)

張鳳清(1967— )，女，副教授，碩士，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物抗氧保鮮特性。E-mail：zfq671025@163.com