杜 蓉，王曉潔,*，許 清，阮 新，劉新生，曲彥清，楊立紅，肖顏顏

(1.魯東大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 煙臺 264025；2.煙臺出入境檢驗檢疫局，山東 煙臺 264000；3.魯東大學(xué)校醫(yī)院，山東 煙臺 264025)

富鍺大麥苗體內(nèi)外抗腫瘤作用

杜 蓉1，王曉潔1,*，許 清1，阮 新2，劉新生3，曲彥清3，楊立紅1，肖顏顏1

(1.魯東大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 煙臺 264025；2.煙臺出入境檢驗檢疫局，山東 煙臺 264000；3.魯東大學(xué)校醫(yī)院，山東 煙臺 264025)

目的：研究富鍺大麥苗的體內(nèi)外抗腫瘤作用。方法：建立小鼠S-180肉瘤模型，富鍺大麥苗連續(xù)灌胃12d，觀察其對荷瘤小鼠瘤質(zhì)量、胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)的影響；同時采用MTT法研究富鍺大麥苗體外對小鼠S-180肉瘤細胞及小鼠SP-2骨髓瘤細胞增殖抑制作用。結(jié)果：富鍺大麥苗高劑量組可明顯抑制小鼠體內(nèi)S-180肉瘤的生長(P＜0.05)，抑瘤率為68.52%，且明顯提高小鼠的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)(P＜0.05)；富鍺大麥苗具有明顯的抑制小鼠S-180肉瘤細胞及小鼠SP-2骨髓瘤細胞體外增殖的作用，且與富鍺劑量呈正相關(guān)。結(jié)論：富鍺大麥苗在體內(nèi)和體外都有明顯的抑制腫瘤增殖的作用。

富鍺大麥苗；S-180瘤株；SP-2瘤株；小鼠

關(guān)于大麥苗營養(yǎng)的利用，《本草綱目》早有記載。近年研究發(fā)現(xiàn)大麥苗的蛋白質(zhì)含量明顯高于籽粒[1]，新鮮的麥苗富含活性礦物質(zhì)、維生素、酶等，可消除氧自由基，分解體內(nèi)毒素，達到抗衰老、消除醫(yī)藥品公害、消除重金屬富集，預(yù)防癌癥[2]的功效。

鍺的化合物分為有機鍺和無機鍺兩種，無機鍺對人體有一定的毒副作用，而有機鍺具有廣泛的調(diào)節(jié)機體免疫力、保肝、抗腫瘤[3]、抗衰老以及抗氧化的作用。本研究采用生物富集鍺的方法[4]，利用價廉的大麥苗作為富鍺對象，將無機鍺轉(zhuǎn)化為有機鍺，以期達到大麥苗和有機鍺的雙重功效。富鍺大麥苗對于小鼠免疫功能的免疫調(diào)節(jié)作用以及保肝作用已經(jīng)得到實驗驗證[5]。本實驗通過建立小鼠S-180肉瘤動物模型，觀察富鍺大麥苗體內(nèi)抗腫瘤的作用；以小鼠S-180，SP-2細胞株為對象采用MTT比色法來研究富鍺大麥苗的體外抗腫瘤作用，為進一步研究和開發(fā)其營養(yǎng)價值提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

健康昆明種小鼠36只，雌性，體質(zhì)量20～30g，由山東綠葉制藥有限公司動物房提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(魯)20090009；鼠肉瘤細胞S-180(S-180)瘤株由上海細胞所提供；鼠骨髓瘤細胞SP2/0-Ag14(SP-2)瘤株由武漢細胞保藏中心所提供。

二氧化鍺(AR) 國藥集團化學(xué)試劑有限公司；二甲基亞砜(DMSO)(AR) 天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心；四甲基偶氮唑蘭(MTT) Sigma公司；RPMI 1640 Gibco公司； 胎牛血清(FBS) 生工生物工程(上海)有限公司；生理鹽水；5-氟尿嘧啶(5-FU)。

超凈工作臺；CO2恒溫培養(yǎng)箱；酶標(biāo)儀；96孔細胞培養(yǎng)板；針式直徑2.5cm微孔濾膜濾器。

1.2 方法

1.2.1 大麥苗汁的制備[4]

采用水培法和不同的富鍺方法，篩選出浸麥富鍺質(zhì)量濃度為80mg/L(有機鍺含量為4.05μg/g）的大麥苗進行大批量培育[4]。將收割的富鍺大麥苗按照每100g加100mL生理鹽水，研磨，過濾，配成1g/mL的富鍺大麥苗原汁，另稀釋為0.5、0.1g/mL，同樣方法配制1g/mL的正常大麥苗汁，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2.2 富鍺大麥苗對荷S-180肉瘤小鼠抗腫瘤作用

1.2.2.1 動物分組及給藥

將小鼠隨機分為對照組，富鍺大麥苗低、中、高劑量組(簡稱富鍺低、中、高劑量組)，正常大麥苗組，5-FU組共6組，每組6只。富鍺低、中、高劑量組灌藥質(zhì)量濃度分別為0.1、0.5、1g/mL，正常大麥苗組為1g/mL，5-FU組288μg/mL[6]作為抗腫瘤陽性對照。實驗組每天灌胃一次，每次0.2mL，連續(xù)12d，對照組給予等量的生理鹽水。各組小鼠自由飲食、飲水。12d后每只小鼠于左前肢腋下接種S-180瘤細胞懸液(3×106個/mL)0.1mL，繼續(xù)灌胃12d后停藥。5-FU組接種S-180，3d后開始灌服5-FU，方法同上，共3d。

1.2.2.2 抑瘤率、胸腺指數(shù)及脾臟指數(shù)的測定

末次給藥24h，稱質(zhì)量后頸椎脫臼處死小鼠，取瘤塊、胸腺、脾臟稱質(zhì)量，計算抑瘤率[7]、胸腺指數(shù)[8]、脾指數(shù)。

1.2.3 富鍺大麥苗對S-180、SP-2細胞增殖的抑制作用

分別常規(guī)接種S-180、SP-2細胞于含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液中，37℃、5%CO2飽和濕度的條件下培養(yǎng)。采用MTT比色法[9]測定細胞增殖抑制率：取對數(shù)生長期的細胞，用含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液配成密度為2×105個/mL的細胞懸液，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100μL。實驗分為對照組，富鍺低(0.1g/mL)、中(0.5g/mL)、高劑量組(1.0g/mL)，正常麥苗組(1.0g/mL)和5-FU組(288μg/mL)6組，每組設(shè)6個復(fù)孔。各組分別按要求加入麥苗汁或5-FU 100μL，對照組加入等量的培養(yǎng)液，常規(guī)培養(yǎng)24h。實驗用麥苗汁和5-FU均經(jīng)過0.45μm微孔濾膜過濾除菌。24h后，每孔加入20μL 5mg/mL MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4h，終止培養(yǎng)，棄去孔內(nèi)上清。每孔加入150μL DMSO，搖床振蕩10min，用酶標(biāo)儀測波長490nm處OD值。

式中：OD1為對照組平均OD值；OD2為實驗組平均O D值。

1.2.4 統(tǒng)計學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)均采用x±s表示，數(shù)據(jù)采用SPSS16.0統(tǒng)計分析軟件進行處理，兩兩比較采用t檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 富鍺大麥苗體內(nèi)抗腫瘤作用

2.1.1 富鍺大麥苗對荷S-180肉瘤小鼠體質(zhì)量和瘤質(zhì)量的影響

表1 富鍺大麥苗對荷S-180肉瘤小鼠體質(zhì)量和瘤質(zhì)量的影響(±s)Table 1 Effect GEBS on body weight and tumor weight of mice with S-180 sarcoma±s)

表1 富鍺大麥苗對荷S-180肉瘤小鼠體質(zhì)量和瘤質(zhì)量的影響(±s)Table 1 Effect GEBS on body weight and tumor weight of mice with S-180 sarcoma±s)

注：a.與對照組比較，差異極顯著(P＜0.01)；b.與對照組比較，差異顯著(P＜0.05)；d.與5-FU組比較，差異顯著(P＜0.05)。

組別 動物數(shù) 體質(zhì)量/g瘤質(zhì)抑瘤始終始終量/g率/%對照組66 30.31±0.5134.00±0.470.54±0.06—富鍺低劑量組66 28.87±0.3834.30±0.370.46±0.0414.81富鍺中劑量組66 29.22±0.3733.98±0.570.25±0.01a53.70d富鍺高劑量組66 29.25±0.4933.03±0.670.17±0.01a68.52d正常大麥苗組65 29.20±0.4832.78±0.370.18±0.09a66.67d5-FU組64 29.48±0.4933.13±0.640.33±0.03b38.89

如表1所示，給藥12d后各組小鼠體質(zhì)量與給藥前比較均有所增加，但組間比較無明顯差異。說明富鍺

大麥苗對荷瘤小鼠的體質(zhì)量變化無明顯影響。與對照組比較，富鍺低劑量組瘤質(zhì)量無明顯變化，其他各組瘤質(zhì)量明顯降低(P＜0.05)。富鍺低、中、高劑量組的抑瘤率分別為14.81%、53.70%、68.52%，正常大麥苗組抑瘤率為66.67%，5-FU組抑瘤率為38.89%；富鍺中、高劑量組以及正常大麥苗組的抑瘤率均高于5-FU組(P＜0.05)。

2.1.2 富鍺大麥苗對荷S-180肉瘤小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)的影響

表2 富鍺大麥苗對荷S-180肉瘤小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)的影響(±s,n=6)Table 2 Effect GEBS on thymus index and spleen index of mice with S-180 sarcoma±s,n=6)

表2 富鍺大麥苗對荷S-180肉瘤小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)的影響(±s,n=6)Table 2 Effect GEBS on thymus index and spleen index of mice with S-180 sarcoma±s,n=6)

注：b.與對照組比較，差異顯著(P＜0.05)

組別胸腺質(zhì)量/mg胸腺指數(shù)/(mg/g)脾臟質(zhì)量/mg脾臟指數(shù)/(mg/g)對照組106.77±10.653.14±0.31166.88±2.294.88±0.08富鍺低劑量組121.28±8.093.54±0.28163.99±8.944.75±0.22富鍺中劑量組85.50±7.682.52±0.25169.52±4.225.00±0.16富鍺高劑量組156.60±15.48b4.75±0.45b203.17±2.16b6.15±0.12b正常大麥苗組111.76±6.523.41±0.19199.96±6.76b6.07±0.22b5-FU組94.70±13.362.86±0.41152.43±11.164.59±0.31

如表2所示，與對照組相比，富鍺高劑量組胸腺質(zhì)量和胸腺指數(shù)均有明顯提高(P＜0.05)；富鍺高劑量組、正常大麥苗組的脾臟質(zhì)量和脾臟指數(shù)較對照組都有顯著提高(P＜0.05)。

2.2 富鍺大麥苗體外抗腫瘤的作用

2.2.1 富鍺大麥苗體外對S-180細胞增殖的抑制作用

表3 富鍺大麥苗對小鼠S-180細胞增殖的影響(±s,n=6)Table 3 Effect GEBS on cell proliferation in mice with S-180 sarcoma±s,n=6)

表3 富鍺大麥苗對小鼠S-180細胞增殖的影響(±s,n=6)Table 3 Effect GEBS on cell proliferation in mice with S-180 sarcoma±s,n=6)

注：a.與對照組比較，差異極顯著(P＜0.01)；b.與對照組比較，差異顯著(P＜0.05)；c.與正常大麥苗組比較，差異顯著(P＜0.05)；d.與5-FU組比較，有顯著性差異(P＜0.05)。下同。

組別OD490nm生長抑制率/%對照組0.88±0.04—富鍺低劑量組0.60±0.05bd31.42d富鍺中劑量組0.27±0.04bcd69.32cd富鍺高劑量組0.01±0.02ac98.90c正常大麥苗組0.56±0.03bd36.46d5-FU組0.03±0.05a96.10

如表3所示，富鍺低、中、高劑量組均能抑制S-180細胞的增值，其抑制率分別為31.42%、69.32%、98.90%，且與劑量呈正相關(guān)。正常大麥苗組抑制率為36.46%，其明顯低于富鍺中、高劑量組(P＜0.05)；富鍺高劑量組的抑制率能達到5-FU組的水平，其余各組均低于5-FU組(P＜0.05)。

2.2.2 富鍺大麥苗體外對SP-2細胞增殖的抑制作用

表4 富鍺大麥苗對小鼠SP-2細胞增殖的影響(±s,n=6)Table 4 Effect GEBS on cell proliferation in mice with SP-2 sarcoma (±s,n=6)

表4 富鍺大麥苗對小鼠SP-2細胞增殖的影響(±s,n=6)Table 4 Effect GEBS on cell proliferation in mice with SP-2 sarcoma (±s,n=6)

組別OD490nm生長抑制率/ %對照組0.70±0.01—富鍺低劑量組0.56±0.02bd20.37d富鍺中劑量組0.24±0.02bcd66.4cd富鍺高劑量組0.02±0.01ac97.68c正常大麥苗組0.52±0.02bd26.69d5-FU組0.03±0.03a95.39

如表4所示，富鍺低、中、高劑量組均能抑制S-180細胞的增值，其抑制率分別為20.37%、66.4%、97.68%，且與劑量呈正相關(guān)。正常大麥苗組抑制率為26.69%，其明顯低于富鍺中、高劑量組(P＜0.05)；富鍺高劑量組的抑制率能達到5-FU組的水平，其余各組均低于5-FU組(P＜0.05)。

3 討 論

自富鍺保健品的開發(fā)和利用在國內(nèi)開始流行，富鍺產(chǎn)品抗腫瘤作用及其機制的研究一直是熱點。本實驗采用小鼠肉瘤S-180腫瘤模型進行體內(nèi)抗腫瘤實驗及小鼠肉瘤S-180株、骨髓瘤SP-2株進行體外篩選，初步證明了富鍺大麥苗對S-180、SP-2瘤株體內(nèi)外生長有抑制作用。

體內(nèi)抗腫瘤實驗結(jié)果顯示：富鍺中、高劑量組以及正常大麥苗組對小鼠體內(nèi)S-180實體瘤有明顯的抑制作用，效果優(yōu)于5-FU組(這不排除，可能5-FU用量不足而致，牛高華等[10]研究5-FU的體內(nèi)用量為20mg/kg，因本實驗組體內(nèi)用量是按體外實驗用量定的，所以，5-FU也按體外實驗用量設(shè)定(288μg/mL，每只0.2mL)，由此可見，此量和臨床5-FU體內(nèi)用量相比低很多)，且富鍺高劑量組可顯著提高了荷瘤小鼠的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)，正常大麥苗組能明顯提高荷瘤小鼠的脾臟指數(shù)。胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)的提高提示富鍺大麥苗和正常大麥苗組可能通過增強宿主免疫功能而達到抗腫瘤的效果。通過本實驗已證明富鍺大麥苗能夠明顯提高小鼠機體的細胞免疫和體液免疫[5]；有機鍺能誘使人體細胞產(chǎn)生細胞介素和干擾素[11]，同時可能會刺激T淋巴細胞產(chǎn)生淋巴因子，活化巨噬細胞及激活NK活性，從而發(fā)揮殺傷腫瘤細胞的作用[12]，富鍺麥苗抗腫瘤作用可能是大麥苗本身和麥苗中有機鍺的聯(lián)合作用的結(jié)果。5-FU是一種常用的抗腫瘤化療藥，其主要是直接抑制腫瘤的生長，本實驗也證明5-FU并沒有提高胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)的作用。富鍺高劑量組和正常大麥苗組對小鼠體內(nèi)S-180實

體瘤有明顯的抑制作用，效果優(yōu)于5-FU組，這提示體內(nèi)抗腫瘤主要是通過提高機體的免疫力達到抗腫瘤的作用，但也不排除，因本實驗使用5-FU時間和實驗組不同步，只用了3d所致，因為前期研究發(fā)現(xiàn)5FU隨使用時間加長，其抑瘤率增加的同時其毒副作用也增加，出現(xiàn)實驗動物明顯消瘦和死亡。因而本實驗選用3d，即出現(xiàn)了其抑瘤作用與毒副作用都不明顯。以上提示：腫瘤病人化療期間，在使用一般化療藥物時最好同時配合使用提高機體免疫力的藥物，才能達到更好的效果。

本研究進行體內(nèi)抗腫瘤實驗，是先采取實驗組提前灌胃12d，然后造腫瘤模型再繼續(xù)灌胃12d，目的是先激活機體的免疫系統(tǒng)，使其抗腫瘤效果更好。前期研究也曾造模同時進行灌胃，但抑瘤率只能達到30%左右，這提示用富鍺大麥苗抗腫瘤應(yīng)作為輔助物使用，因其作用發(fā)揮較慢，并且需要達到一定的劑量和時間才能達到預(yù)期的效果。

體外實驗結(jié)果顯示，富鍺大麥苗對小鼠肉瘤S-180細胞、小鼠骨髓瘤SP-2細胞增殖均有明顯的抑制作用，且隨著富鍺質(zhì)量濃度的升高抑制作用加強，表現(xiàn)出一定的量效關(guān)系。富鍺中、高劑量組效果明顯優(yōu)于正常麥苗組，且高劑量組效果能達到5-FU組的水平。通過體外實驗證明富鍺大麥苗對腫瘤細胞有直接抑制作用，其對腫瘤細胞直接抑制作用可能是有機鍺的作用，有研究表明有機鍺-132(β-羧乙基鍺三氧化物)和螺鍺(8,8-二烷基-2-氮雜-8-鍺雜螺癸烷)抑制腫瘤活性的可能機制包括增強機體免疫力，清除自由基和抗突變等多個方面，許多生物活性的有機鍺化合物分子中與鍺原子配位的通常是氧、硫和氮之類的強電負性原子，由于它們對電子的吸收作用導(dǎo)致鍺原子周圍的電子云偏離原子核而形成一個正電中心，當(dāng)有機鍺化合物遇到腫瘤細胞時，其正電中心可增加腫瘤細胞的電勢能，降低其活動能力，從而起到抑制和殺死腫瘤細胞的作用，這就是有機鍺化合物抑制腫瘤活性的生物電位學(xué)說[13]。任迎春等[14]證明雙β-羧己基鍺氫氧化物可抑制肝癌細胞的分裂，形成大量的裸核，而鍺-132則無明顯的抑制肝癌細胞分裂的作用。因而，不同的有機鍺，可能抗腫瘤的作用機制有所不同，并且對不同的腫瘤細胞也可能作用不同。本實驗富鍺大麥苗對兩種小鼠瘤細胞(一種是實體瘤細胞肉瘤S-180，一種骨髓瘤SP-2)作用效果一樣，這說明富鍺大麥苗對分裂周期較快的細胞均有抑制作用，其可能對細胞分裂某個周期有抑制作用，有待繼續(xù)探究。

本研究結(jié)果表明，富鍺大麥苗在體內(nèi)和體外均有明顯的抑制腫瘤的作用，且本實驗中其沒出現(xiàn)任何毒副作用，認(rèn)為富鍺大麥苗是一種很好的口服抗腫瘤輔助物。但其對腫瘤細胞生長周期的抑制作用以及大麥苗的中的有機鍺是以何種結(jié)合形式存在還有待深入研究。

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in vitro Anti-tumor Effect of Germanium-riched Barley Seedling

DU Rong1，WANG Xiao-jie1,*，XU Qing1，RUAN Xin2，LIU Xin-sheng3，QU Yan-qing3，YANG Li-hong1，XIAO Yan-yan1
(1. College of Life Science, Ludong University, Yantai 264025, China；2. Yantai Entry and Exit Inspection and Quarantine Bureau, Yantai 264000, China；3. College Hospital, Ludong University, Yantai 264025,China)

Objective: To investigate the anti-tumor effect of Germanium-enriched barley seedling (GEBS) in vivo and in vitro. Methods: The S-180 model mice were administered with GEBS at different dosages by gavage for 12 consecutive days. The effect of GEBS on tumor weight, thymus index and spleen index of mice was explored. Meanwhile, the inhibition effect of GEBS on the proliferation of mouse sarcoma cell S-180 and myeloma cell SP-2 was also evaluated by MTT assay. Results: GEBS with high dosage could obviously suppress the growth of S-180 sarcoma in mice with an inhibition rate of 68.52% (P＜0.05) and increase the thymus index and spleen index (P＜0.05). Moreover, GEBS could obviously inhibit the growth of mouse sarcoma cell S-180 and myeloma cell SP-2 in vitro in a positive dosage-dependent manner. Conclusion: GEBS can obviously inhibit the growth of tumor in vivo and in vitro.

germanium-rich barley seedling；sarcoma S-180；myeloma SP-2；mice

TS201.2

A

1002-6630(2010)23-0371-04

2010-08-27

煙臺市科學(xué)技術(shù)發(fā)展計劃項目(2007152)

杜蓉(1984—)，女，碩士研究生，主要從事動物免疫學(xué)研究。E-mail：xiaowu_5533@163.com

*通信作者：王曉潔(1962—)，女，教授，博士，主要從事動物生理學(xué)及免疫學(xué)研究。E-mail：wxj10304@126.com