曾 亮，吳靚靚，官興麗，羅理勇，劉永勝

(1. 西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715；2. 長沙華誠生物科技有限公司，湖南 長沙 410205)

兒茶素對馬鈴薯酪氨酸酶的抑制作用

曾 亮1，吳靚靚1，官興麗1，羅理勇1，劉永勝2

(1. 西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715；2. 長沙華誠生物科技有限公司，湖南 長沙 410205)

采用分光光度計(jì)法測定酶液加入量、底物濃度、溫度、pH值對酶活力的影響，確定最適反應(yīng)條件。在30℃、pH6.8的Na2HPO4-NaH2PO4緩沖體系中，采用酶動(dòng)力學(xué)方法研究兒茶素對馬鈴薯酪氨酸酶的抑制效應(yīng)。結(jié)果表明：反應(yīng)最適條件為酶液加入量0.5mL、底物濃度2mmol/L、溫度30℃、pH6.8。兒茶素對馬鈴薯酪氨酸酶有抑制作用，抑制率達(dá)到50% 的兒茶素質(zhì)量濃度(IC50)約為0.27mg/mL；Lineweaver-Burk圖顯示兒茶素對馬鈴薯酪氨酸酶的抑制作用表現(xiàn)為競爭型抑制，抑制常數(shù)(KI)為0.16mg/mL。

酪氨酸酶；兒茶素；抑制作用；動(dòng)力學(xué)

酪氨酸酶(EC，1.14.18.1)又稱多酚氧化酶，是一種銅蛋白，其活性中心的雙核銅離子在酶催化中起重要作用，是黑色素生成的關(guān)鍵酶[1-5]。由于黑色素合成與酪氨酸酶有很大關(guān)系，目前，對酪氨酸酶抑制劑的研究非常多，如氫醌、熊果苷、V C、V C衍生物、曲酸等，但是隨著化妝品行業(yè)的發(fā)展，如氫醌等具有很大細(xì)胞毒性的物質(zhì)已很少采用，而VC 不穩(wěn)定易氧化，曲酸對皮膚有刺激作用，但來自植物等提取物的天然成分則很少有負(fù)面影響[6]。

茶多酚作為茶葉中黃烷醇類、黃酮、黃酮醇類、花青素類、茶白素類和酚酸及縮酚酸類組成的混合物，主要成分是黃烷醇衍生物，俗稱兒茶素，能清除人體自由基，抑制過氧化，起到祛斑、防曬及抗皮膚色素沉著的作用[7-8]。研究發(fā)現(xiàn)[9]，10種傳統(tǒng)的韓國茶提取物能抑制蘑菇酪氨酸酶的活性，綠茶提取物是一種強(qiáng)烈的抑制劑，主要活性物質(zhì)是ECG、GCG、EGCG；且所有兒茶素的沒食子酸基是活性位點(diǎn)，GCG表現(xiàn)為競爭性抑制。不同茶葉醇提物抑制酪氨酸酶活性，青茶抑制率達(dá)到62.28%[10]。本研究以兒茶素為效應(yīng)物，研究其對馬鈴薯酪氨酸酶活性的影響及抑制作用機(jī)理，得到有關(guān)動(dòng)力學(xué)參數(shù)，為兒茶素能在化妝品和醫(yī)藥上得到更好的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

馬鈴薯 市售。

98%兒茶素 長沙華誠生物科技有限公司；L-多巴(D9628) Sigma 公司；初酪氨酸酶 自提；Na2HPO4·12H2O、

NaH2PO4·2H2O均為分析純。

722可見分光光度計(jì) 上海菁華科技儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 酪氨酸酶提取液的制備[11-12]

稱取去皮切碎馬鈴薯2g(-20℃冷凍過夜)，按1:5 (m/V)的比例加入磷酸鹽緩沖液(pH6.8)10mL，用力研磨擠壓1min，立即3000r/min離心5min，傾出上清液保存于4℃冰箱，在2h內(nèi)用完。

1.2.2 酶活力測定方法[13-16]

酪氨酸酶活力的測定是基于L-酪氨酸和L-多巴的酶催化氧化產(chǎn)物——多巴色素(dopachrome)在475nm 波長處有最大吸收，其吸光系數(shù)為ε=3700mol/(L·cm)。酪氨酸酶反應(yīng)活性(A C T)定義：以每分鐘多巴色素在475nm 波長的吸光度(OD475nm)增加0.001 為一個(gè)酶活力單位，即1μmol/min。因此，通過測定酶催化反應(yīng)體系的OD475nm隨時(shí)間的增長直線，從直線斜率即可求得酶活力。

在10mL 試管中加入1mL L-多巴(6mmol/L)及1.5mL 磷酸鹽緩沖液(pH6.8)中，充分混勻，于30℃水浴中溫育10min后，加入0.5mL 酶提液，立即充分混勻，測定OD475nm。

1.2.2.1 酶活力測定的最適條件的選擇[12]

時(shí)間對酪氨酸酶穩(wěn)定性的影響：依照以上測定方法，分別在提取出馬鈴薯酪氨酸酶0、0.5、1、2.0、2.5h時(shí)測定酶活力。

最適酶液加入量的選擇：依照以上測定方法，分別取馬鈴薯酪氨酸酶提取液0.1、0.3、0.5、1.0、1.2mL測定酶活力。

最適底物濃度的選擇：依照以上測定方法，分別在試管中加入0.5、0.7、0.9、1.0、1.1、1.2mL L-多巴，使底物濃度分別為1.0、1.4、1.8、2.0、2.2、2.4mmol/L，測定酶活力。

最適溫度的選擇：依照以上測定方法，分別將L-多巴溶液和磷酸鹽緩沖液混合后，于25、30、40、60、70℃水浴中溫育，測定酶活力。

最適pH值的選擇：依照以上方法，分別在試管中加入pH值為5.8、6.5、6.8、7.0、7.5、8.0的磷酸鹽緩沖液，測定酶活力。

1.2.2.2 兒茶素對馬鈴薯酪氨酸酶活力影響的測定及抑制率的計(jì)算

在若干10mL試管中按表1加入L-多巴(6mmol/L)及磷酸鹽緩沖液(pH6.8)，充分混勻，于30℃水浴中溫育10min后，加入0.5mL不同質(zhì)量濃度(0、0.12、0.24、0.36、0.5、1、2、4mg/mL)的兒茶素溶液，然后加入0.5mL酶提液，立即充分混勻，測定OD475nm[8]。具體操作如下：

表1 兒茶素對馬鈴薯酪氨酸酶活力影響實(shí)驗(yàn)的樣品加入順序Table 1 Different reaction system composition for determining optimal reaction conditions of potato tyrosinase

按以下公式計(jì)算兒茶素對馬鈴薯酪氨酸酶的抑制率：

式中：OD1、OD2、OD3、OD4、分別表示處理組1、2、3、4生物O D475nm值。

2 結(jié)果與分析

2.1 反應(yīng)最適條件的優(yōu)化

2.1.1 酶穩(wěn)定性

圖1 時(shí)間對酪氨酸酶穩(wěn)定性的影響Fig.1 Effect of duration of storage at 4 ℃ on potato tyrosinase activity

由圖1可見，馬鈴薯酪氨酸酶液在2.0h內(nèi)酶活力變化不大，說明在此時(shí)間內(nèi)使用酶液，酶活力變化對實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成的影響較小。

2.1.2 最適酶液加入量

圖2 酶液加入量對酶活力的影響Fig2 Effect of quantity of enzyme solution on potato tyrosinase activity

當(dāng)酶液加入過多，造成酶液過量，底物不夠，酶

活力增長緩慢甚至下降；酶液過少，酶活力變化較小，趨勢不明顯。由圖2可見，加入1mL酶液，已近飽和，故選擇0.5mL為最適加入量。

2.1.3 最適底物濃度

圖3 底物濃度對酶活力的影響Fig.3 Effect of substrate concentration on potato tyrosinase activity

由圖3可見，當(dāng)?shù)孜餄舛仍?～2mmol/L時(shí)，酶活力隨底物濃度的增大而增加，達(dá)到2mmol/L后，隨著底物濃度的增加，酶活力增加較為緩慢，故選擇2mmol/L為最適底物濃度。

2.1.4 最適溫度

圖4 溫度對酶活力的影響Fig.4 Effect of reaction temperature on potato tyrosinase activity

溫度是酶催化反應(yīng)的重要條件。對酶具有雙重作用，溫度能加速酶反應(yīng)速率，但溫度過高，會(huì)加速酶蛋白變性。由圖4 可見，30℃時(shí)酪氨酸酶的活性最高。

2.1.5 最適pH值

圖5 pH值對酶活力的影響Fig.5 Effect of reaction pH on potato tyrosinase activity

pH值也是酶催化反應(yīng)的重要條件。由圖5可知，當(dāng)pH值 在5.8～6.8之間時(shí)，酶活力隨pH 值的增大而增加，小于6.8，酶活力相對降低，故選擇pH6.8為最適條件。

2.2 兒茶素對馬鈴薯酪氨酸酶活力的影響

圖6 兒茶素質(zhì)量濃度對馬鈴薯酪氨酸酶活力的影響Fig.6 Effect of concentration of added catechins on potato tyrosinase activity

圖6為兒茶素對馬鈴薯酪氨酸酶活力的抑制作用曲線，結(jié)果表明兒茶素對馬鈴薯酪氨酸酶具有抑制作用。酪氨酸酶加入量一定，當(dāng)兒茶素質(zhì)量濃度小于0.5mg/mL，抑制率隨著兒茶素濃度的增大而增大；當(dāng)兒茶素質(zhì)量濃度大于0.5mg/mL，抑制率增大趨于平緩，這由于兒茶素濃度達(dá)到一定值后，兒茶素過量，酪氨酸酶量飽和，活性降低不明顯。抑制率達(dá)到50%的兒茶素質(zhì)量濃度(IC50)約為0.27mg/mL。

2.3 兒茶素對馬鈴薯酪氨酸酶的抑制動(dòng)力學(xué)分析

圖7 兒茶素對馬鈴薯酪氨酸酶抑制作用的Lineweaver-Burk曲線Fig.7 Lineweaver-Burk plots for the inhibition of catechins on potato tyrosinase activity

圖8 斜率與兒茶素質(zhì)量濃度關(guān)系圖Fig.8 Relationship between slope and catechins concentration

在測酶活體系中，固定加入酶量，改變底物L(fēng)-多巴的濃度，測定酶在不同濃度抑制劑下的催化活力。以酶反應(yīng)的初速度的倒數(shù)對底物濃度Cs作圖為一組雙曲線，說明酶促反應(yīng)遵循米氏(Michaelis-Menten)動(dòng)力學(xué)方程。以Lineweaver-Burk 雙倒數(shù)作圖，可以判斷兒茶素對該酶的抑制作用類型。結(jié)果如圖7所示，以Lineweaver-Burk 雙倒數(shù)作圖為相交于一點(diǎn)在縱坐標(biāo)的一組直線，直線橫軸截距隨兒茶素質(zhì)量濃度的改變而改變，而縱軸截距保持不變，表現(xiàn)為競爭型抑制。二次作圖，以斜率對兒茶素質(zhì)量濃度作回歸直線，見圖8，可以求出兒茶素對馬鈴薯酪氨酸酶的抑制常數(shù)(KI)為0.16mg/mL。

3 討 論

探究酶液加入量、底物濃度、溫度、pH值 4個(gè)因素對馬鈴薯酪氨酸酶活力的影響，發(fā)現(xiàn)均有一定程度的影響，當(dāng)酶液加入量0.5mL、底物濃度2mmol/L、溫度30℃、pH6.8時(shí)，反應(yīng)達(dá)到最佳水平。其中酶液加入量是針對本實(shí)驗(yàn)參照其他方法并有所改進(jìn)的酶液制備方法而得到的，在不同的制備方法下，得到最適條件會(huì)存在不同。由于實(shí)驗(yàn)中不同的馬鈴薯中所含酪氨酸酶活性有所不同，同一馬鈴薯不同部位的酪氨酸酶活性也有所差異，實(shí)驗(yàn)中應(yīng)采用新鮮、大小相似、同一部位馬鈴薯提取出的酪氨酸酶液，并在短時(shí)間內(nèi)使用完，以降低實(shí)驗(yàn)誤差。

兒茶素對馬鈴薯酪氨酸酶有抑制作用，IC50為0.27mg/mL；Lineweaver-Burk 圖顯示兒茶素對馬鈴薯酪氨酸酶的抑制作用為競爭型抑制，其抑制常數(shù)(KI)為0.16mg/mL。也就是說，兒茶素能抑制酪氨酸酶的活性中心，與底物L(fēng)-多巴競爭，導(dǎo)致酶活力下降。除此之外，由于兒茶素結(jié)構(gòu)中存在多個(gè)酚羥基，具有很強(qiáng)的清除自由基能力，而反應(yīng)需在有氧的環(huán)境中進(jìn)行，在一定程度上會(huì)抑制酪氨酸酶的表達(dá)。

兒茶素作為一種天然的茶葉提取物，要充分發(fā)揮其在化妝品及醫(yī)藥業(yè)上的用途，仍需加強(qiáng)進(jìn)一步研究，如其對體外培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞及在活體中對動(dòng)物皮膚的影響，乃至對人酪氨酸酶的影響，在基因水平上的影響等等。而且兒茶素有4個(gè)單體，不同的單體對酪氨酸酶抑制效果可能存在不同，加之本身性質(zhì)活潑，容易被氧化，針對兒茶素的特點(diǎn)來開發(fā)利用對其今后的發(fā)展想必會(huì)有幫助。總之，兒茶素是一種具有市場潛力的酪氨酸酶抑制劑。

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Inhibitory Effect of Catechins on Potato Tyrosinase

ZENG Liang1，WU Liang-liang1，GUAN Xing-li1，LUO Li-yong1，LIU Yong-sheng2
(1. College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715, China；2. Changsha Huacheng Biotechnology Co. Ltd., Changsha 410205, China)

The effects of the quantity of enzyme solution, substrate concentration, temperature and pH on the activity of potato tyrosinase were determined by spectrophotometer method in order to determine the optimal reaction conditions of potato tyrosinase. Along with this, the inhibitory effect of catechins on potato tyrosinase in a Na2HPO4-NaH2PO4 buffer solution (pH 6.8) at 30 ℃ was examined by enzymatic kinetics methods. The optimal conditions for the reaction of potato tyrosinase were found to be adding 0.5 mL of the crude tyrosinase solution extracted from potato to the 2 mmol/L substrate solution for reaction at 30 ℃, pH 6.8. Catechins could inhibit potato tyrosinase, and the concentration for 50% inhibition rate was approximately 0.27 mg/mL. The Lineweaver-Burk plot showed that the inhibitory effect of catechins on potato tyrosinase was competitive, and the inhibition constant (KI) was 0.16 mg/mL.

tyrosinase；catechins；inhibitory effect；kinetics

O625.31

A

1002-6630(2010)23-0310-04

2010-09-20

西南大學(xué)基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)(XDJK2010C076)；教育部博士點(diǎn)基金項(xiàng)目(20100182120014)

曾亮(1980—)，女，副教授，博士，主要從事茶及天然產(chǎn)物研究與開發(fā)。E-mail：zengliangbaby@126.com