陳 亮，蘭海楠，鄭 鑫，劉景圣,*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長春 130118；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林 長春 130118)

長白山林蛙輸卵管糖蛋白多抗制備及應(yīng)用研究

陳 亮1，蘭海楠2，鄭 鑫2，劉景圣1,*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長春 130118；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林 長春 130118)

針對(duì)長白山林蛙輸卵管糖蛋白制備特異性多克隆抗體。將新鮮林蛙輸卵管蛋白粗提液經(jīng)Sepharose Fast Flow陰離子交換柱和Sephadex G-100凝膠層析柱獲得純化的輸卵管糖蛋白組分。以純化輸卵管糖蛋白免疫新西蘭大白兔，制備多抗血清，采用辛酸-飽和硫酸銨法對(duì)多抗進(jìn)行純化并鑒定。結(jié)果表明：純化后的多抗ELISA效價(jià)為1:64000，純化多抗具有較高的敏感性和特異性，效價(jià)較高。利用制備的多抗對(duì)長白山林蛙輸卵管分泌細(xì)胞進(jìn)行免疫組織化學(xué)定位，為分泌細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)物中輸卵管糖蛋白進(jìn)行檢測提供研究條件。

長白山林蛙；輸卵管糖蛋白；抗體；免疫組化

長白山林蛙(Rana chensinensis Changbaishanensis)屬中國林蛙長白山亞種，主要分布于我國東北長白山和小興安嶺地區(qū)，是我國特有的藥用兩棲動(dòng)物[1-2]。雌性林蛙輸卵管排卵前的干品俗稱林蛙油(蛤蟆油)，因其中含有多種生物活性成分如氨基酸、雌二醇、糖蛋白等[3]而成為與人參、鹿茸齊名的珍貴滋補(bǔ)保健品[4-5]。據(jù)中華人民共和國藥典記載[6]，林蛙油具有滋陰補(bǔ)腎功能，用于身體虛弱，病后失調(diào)，精力耗損，心悸失眠等癥。近年的大量研究也表明，林蛙油對(duì)肝臟具有保護(hù)作用[7]，能明顯降低肝損傷程度，能降低高血脂癥大鼠血清中總膽固醇、甘油三酯和血清脂蛋白的含量[8]，此外還具有明顯的抗焦慮作用[9]、抗疲勞作用，可調(diào)節(jié)人體內(nèi)分泌，在醫(yī)學(xué)界素有“軟黃金”之稱[10-11]。目前，保健品市場上對(duì)林蛙油的需求量大幅上升，導(dǎo)致大量捕殺野生林蛙取油，造成野生林蛙數(shù)量急劇下降，嚴(yán)重破壞了生態(tài)平衡。為此，亟待開展對(duì)林蛙輸卵管生長發(fā)育規(guī)律、輸卵管中生物活性物質(zhì)的產(chǎn)生及其生理功能的研究，探索新的方法和途徑，解決林蛙油供不應(yīng)求的問題，以維護(hù)生態(tài)平衡。

糖蛋白是指由糖鏈與多肽鏈以多種形式共價(jià)修飾而形成的一類具有重要生理活性的結(jié)合蛋白質(zhì)[12]，具有開關(guān)、調(diào)諧、作為激素、胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)、保護(hù)、促進(jìn)物質(zhì)吸收、參與血液凝固、參與細(xì)胞識(shí)別等多方面的重要生理活性[13]。糖蛋白對(duì)人類健康的重要作用越來越受到

重視，糖類和蛋白質(zhì)的相互作用參與了許多生理和病理過程，目前利用糖蛋白的靶向性設(shè)計(jì)抗腫瘤藥物，以及應(yīng)用免疫原性制備多糖結(jié)合疫苗，激發(fā)免疫系統(tǒng)達(dá)到治療目的，通過生物療法提高治療效果，已成為越來越重要的治療手段[14]。1934年日本學(xué)者久保田晴光等[15]對(duì)林蛙油成分進(jìn)行了分析，結(jié)果表明林蛙油的主要成分為蛋白質(zhì)，占總量的5 6.3%。對(duì)林蛙輸卵管糖蛋白(oviduct glycoprotein，OGP)的初步研究結(jié)果顯示，輸卵管組織中可溶性糖蛋白含量極高，約占輸卵管蛋白質(zhì)總量的58.3%～65.7%，其含量上暗示林蛙OGP具有獨(dú)特的生理活性功能，在林蛙油的保健功能方面發(fā)揮著一定作用。本研究以提取后純化的林蛙輸卵管糖蛋白免疫新西蘭大白兔，制備了針對(duì)林蛙輸卵管糖蛋白的特異性多抗，對(duì)輸卵管分泌細(xì)胞進(jìn)行免疫組織化學(xué)定位，為長白山林蛙輸卵管分泌細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)物中糖蛋白的提取與檢測，輸卵管分泌細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)物中糖蛋白與林蛙OGP的比較提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，為林蛙OGP的人工合成及林蛙輸卵管功能性食品的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為雄性新西蘭大白兔3只，體質(zhì)量2.5kg左右，購自吉林大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心；長白山林蛙選取柳河市安口鎮(zhèn)地區(qū)3年齡雌性冬眠期、發(fā)情期以及排卵后的林蛙。

羊抗兔酶標(biāo)二抗 北京中衫金橋生物公司；96孔酶標(biāo)板 Constar公司，其他常規(guī)試劑均為分析純。

UV-2450紫外-可見分光光度計(jì) 日本島津公司；AKTA Prime Plus蛋白純化儀 GE公司；VE-180垂直電泳儀 Tanon公司；WFH-103自動(dòng)凝膠成像儀 上海精密科學(xué)儀器有限公司；XW-QP-003切片機(jī) 萊卡公司；CK×41倒置光學(xué)顯微鏡 Olympus公司。

1.2 OGP的提取與純化

1.2.1 OGP的粗提

新鮮林蛙輸卵管組織用10倍質(zhì)量的生理鹽水反復(fù)沖洗輸卵管管腔內(nèi)壁，沖洗液離心除雜。上清用70%飽和度的硫酸銨鹽析，離心棄上清。沉淀用磷酸鹽緩沖液(pH7.4)溶解，離心除去不溶物。棄去沉淀，透析，得林蛙輸卵管粗蛋白，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 OGP的純化

將粗提蛋白過Sepharose Fast Flow(9mm×140mm)層析柱，以1mL/min的流速，0.05～1.01mol/L NaCl的梯度洗脫。紫外分光光度計(jì)于540nm波長范圍檢測吸光度，收集含蛋白部分，透析，-2 0℃保存。

將經(jīng)Sepharose Fast Flow層析柱所得組分過Sephadex G-100(1.6cm×80cm)柱層析，0.05mol/L pH8.0的PBS洗脫，紫外分光光度計(jì)于540nm波長范圍檢測吸光度，收集蛋白組分，苯酚-硫酸法檢測糖含量。

1.2.3 純度鑒定

采用電泳法，檢測OGP的純度。SDS-PAGE檢測純度與分子質(zhì)量，12%分離膠、5%濃縮膠，每孔上樣量為5μL，濃縮膠段采用80V恒壓，分離膠段采用160V恒壓。

1.3 動(dòng)物免疫

1.3.1 陰性血清制備

將家兔稱質(zhì)量，編號(hào)，禁食10h以上并給與飲水后心臟采血，制備血清，用于陰性對(duì)照。

1.3.2 陽性血清制備

用基礎(chǔ)法免疫新西蘭白兔，免疫劑量OGP為1.0mg/只，具體免疫程序如下。首免：純化OGP抗原加等量弗氏完全佐劑，皮下多點(diǎn)免疫。二免：2周后純化抗原加等量弗氏不完全佐劑皮下多點(diǎn)免疫。三免：3周后，同二免。三免后10d耳靜脈采血檢測血清效價(jià)，如效價(jià)達(dá)到要求則進(jìn)行心臟采血。離析血清保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 OGP 多抗的純化

采用辛酸-飽和硫酸銨法[16]對(duì)多抗進(jìn)行純化。純化多抗進(jìn)行12%SDS-PAGE電泳測定抗體分子質(zhì)量，具體操作參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》[17]。抗體的含量測定采用雙波長紫外分光光度法。

1.5 間接ELISA工作濃度的確定

采用雙方陣法確定抗原、抗體最佳工作濃度[18]。用包被液OGP抗原倍比稀釋為1:40、1:80、1:160、1:320、1:640分別包被酶標(biāo)板各行，將純化后的抗體從1:100開始倍比稀釋至1:1600，分別加入各列，37℃溫育1h。加入HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG(1:5000稀釋)100μL，37℃溫育1h。加入底物液避光室溫顯色10min后，加入終止液終止反應(yīng)。OD490nm值接近1.0，且前后稀釋度出現(xiàn)較大變化時(shí)，該孔的抗原包被濃度為OGP最佳工作濃度，該孔多抗的稀釋倍數(shù)為多抗的最佳工作濃度。

1.6 多抗效價(jià)測定

用建立的ELISA方法測定純化抗體效價(jià)，用包被液將OGP 稀釋成10μg/mL，包被酶標(biāo)板，每孔加入100μL 4℃過夜。用PBS-Tween3＇×3洗滌拍干，每孔加入5%羊血清200μL封閉，37℃溫育1h。用PBS-Tween 3＇×3洗滌拍干，將純化好的抗體從1:1000開始倍比稀釋直至1:128000，100μL/孔，37℃溫育1h。用PBS-Tween 3＇×3洗滌拍干，加入HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG(1:5000稀釋)100μL，37℃溫育1h。用PBS-Tween3＇×3洗滌拍干，加入底物液100μL，避光室溫顯色10min后，每孔加50μL終止液(2mol/L H2SO4)終止反應(yīng)。測定OD490nm

值，計(jì)算出陽性血清與陰性血清OD490nm值之比(P/N)，P/N＞2對(duì)應(yīng)最大多抗稀釋倍數(shù)即為純化后多抗的效價(jià)。

1.7 特異性檢測

酶標(biāo)板分別用OGP、正常排卵前雌性林蛙血清、正常排卵前雌性林蛙頭多糖、正常排卵前雌性林蛙皮膚分泌液等包被酶標(biāo)板，用已建立的ELISA方法對(duì)多克隆抗體進(jìn)行特異性檢測。

1.8 免疫組化

分別取排卵前、排卵后新鮮林蛙輸卵管組織塊，放入0.85% NaCl液清洗，再加入Bouin’s固定液固定，進(jìn)行梯度酒精脫水、透明、浸蠟、包埋、切片(片厚5μm)、貼片。首先取切片進(jìn)行常規(guī)HE染色。再選用以制得的抗體進(jìn)行標(biāo)本的免疫組化染色，免疫組化染色的步驟是：切片脫蠟、復(fù)水、修復(fù)、內(nèi)源性過氧化物酶阻斷、羊血清封閉、一抗孵化、二抗孵化、三抗孵化、D A B發(fā)色、終止、脫水、透明、封片。

2 結(jié)果與分析

2.1 OGP的純化

圖1 樣品的陰離子交換柱的分離圖譜圖Fig.1 Separation of the crude fresh OGP-rich extract on Sepharose Fast Flow IEC

圖2 陰離子交換柱中P1的Sephadex G-100凝膠柱層析洗脫曲線Fig.2 Separation of fraction P 1 of the crude fresh OGP-rich extract on Sephadex G-100 SEC

粗提蛋白經(jīng)Sepharose Fast Flow陰離子交換柱層析，可以得到2個(gè)組分，分別為P1、P2，P1為主峰(圖1)。經(jīng)SephadexG-100凝膠層析柱層析，P1的洗脫曲線中得到了2個(gè)對(duì)稱峰，分別為P1-I，P1-Ⅱ。紫外分光光度法和苯酚-硫酸法檢測結(jié)果(圖2)表明：P1-I是蛋白和糖的重合峰，推測其為OGP，P1-Ⅱ?yàn)閱渭兊牡鞍捉M分，與本研究考查的糖蛋白性質(zhì)不符，故不做研究。

2.2 OGP抗原的純度和分子質(zhì)量測定

圖3 純化OGP的SDS-PAGE結(jié)果Fig.3 SDS-PAGE analysis of purified OGP

OGP收集液濃縮后經(jīng)SDS-PAGE分析，結(jié)果顯示其為單一蛋白帶，如圖3所示。OGP經(jīng)Sephadex G-100柱洗脫，曲線顯示多糖為單一峰，峰形基本對(duì)稱，證明所獲得的糖蛋白為均一組分。測定結(jié)果進(jìn)一步說明該蛋白為單一純化糖蛋白。經(jīng)測定純化O G P總糖含量為1 4%，蛋白含量為7 8%，其分子質(zhì)量為1 1 6 k D。雙波長紫外分光法測定純化O G P抗原質(zhì)量濃度為0.862mg/mL。

2.3 純化多抗質(zhì)量濃度測定

利用雙波長紫外分光光度計(jì)法測定純化后抗體質(zhì)量濃度，蛋白質(zhì)量濃度(mg/mL)按公式：OD280nm×1.45-OD260mn×0.74計(jì)算。計(jì)算得純化后抗體質(zhì)量濃度為1.687mg/mL。

2.4 最佳間接ELISA工作濃度

表1 采用雙方陣法確定抗原，抗體最佳工作濃度Table 1 Optimal working concentrations of antigen and antibody determined by double matrix method

通過雙方陣法確定抗原、抗體最佳工作濃度，抗原陰陽性抗體每個(gè)稀釋度做3個(gè)重復(fù)，取平均值，讀取OD490nm值在最接近1.0時(shí)的抗原、抗體稀釋度，作為此抗原、抗體的最佳間接ELISA工作濃度。結(jié)果如表1所示，在抗原1:80、抗體1:800稀釋時(shí)最佳，所以，抗原最佳包被質(zhì)量濃度10μg/mL，抗體最佳稀釋質(zhì)量濃度定為2μg/mL。

2.5 純化多抗效價(jià)測定

抗原包被濃度為1μg/孔，酶標(biāo)二抗稀釋倍數(shù)為1:6000，純化后多克隆抗體效價(jià)測定結(jié)果見表2。P/N＞2對(duì)應(yīng)最大多抗稀釋倍數(shù)為1:64000，所以純化抗體的ELISA效價(jià)為1:64000，結(jié)果如表2所示。

表2 純化抗體效價(jià)Table 2 Titer determination of the purified antibody

2.6 多抗的特異性分析

通過建立的ELISA體系檢測，制備的多抗與長白山林蛙輸卵管糖蛋白OGP呈特異性反應(yīng)，而與其他幾種蛋白不發(fā)生交叉反應(yīng)。特異性分析結(jié)果見表3。

表3 多抗特異性分析結(jié)果Table 3 Specificity analysis of the purified antibody

2.7 OGP分泌細(xì)胞免疫組化定位

表4 免疫陽性細(xì)胞的分布Table 4 Distribution of positive immune cells in different cells and at different development stages

由表4、圖4～6可知，OGP分泌細(xì)胞多分布在固有層單管狀腺內(nèi)，固有層主要由單管狀腺構(gòu)成，管狀腺的導(dǎo)管部和分泌部無明顯區(qū)別，無腺腔，冬眠期細(xì)胞膨大，呈多邊形，免疫組化呈強(qiáng)陽性，可見棕黃色顆粒狀表達(dá)；發(fā)情期細(xì)胞萎縮，可見腺腔，免疫組化呈弱強(qiáng)陽性；排卵后，腺體導(dǎo)管部的管腔縮小，腺體細(xì)胞增多，免疫組化呈陰性。

圖4 冬眠期輸卵管(40×10)Fig.4 Oviduct in hibernation (40×10)

圖5 發(fā)情期輸卵管(40×10)Fig.5 Oviduct in oestrus (40×10)

圖6 排卵后輸卵管(40×10)Fig.6 Oviduct after ovulation (40×10)

3 結(jié) 論

以蛋白作為免疫原制備多抗的研究非常廣泛，技術(shù)也日趨完善。影響多克隆抗體制備是否成功及效價(jià)高低的因素很多，對(duì)免疫原的選擇尤為關(guān)鍵。長白山林蛙OGP是林蛙在繁殖期輸卵管急劇膨大，上皮細(xì)胞和腺體組織極其發(fā)達(dá)而大量分泌產(chǎn)生的，林蛙排卵前OGP在輸卵管組織中含量達(dá)到最高，因此必須控制在排卵前提取才可能保證OGP的提取量。本研究采用經(jīng)Sepharose Fast Flow陰離子交換柱和Sephadex G-100凝膠層析柱對(duì)純化的OGP作為免疫原，不僅符合純度要求而且靈敏度高，從而獲得了特異性強(qiáng)、效價(jià)較高的針對(duì)林蛙OGP的多抗。兩次免疫之間的間隔的選擇對(duì)免疫結(jié)果也具有很大的影響。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，間隔1～2周免疫的動(dòng)

物產(chǎn)生了很好的免疫應(yīng)答，所產(chǎn)生抗體的ELISA效價(jià)達(dá)1:64000，也證明設(shè)計(jì)的OGP抗原是正確的。采用正常排卵前雌性長白山林蛙血清、頭部多糖、皮膚分泌液進(jìn)行特異性實(shí)驗(yàn)，證明免疫產(chǎn)生的抗體是特異性的。通過獲得了高效價(jià)的特異性的OGP抗體。為下階段的研究提供了重要的實(shí)驗(yàn)材料，特別是為長白山林蛙輸卵管分泌細(xì)胞免疫學(xué)定位與鑒定，細(xì)胞體外培養(yǎng)產(chǎn)物中OGP的檢測與提取提供研究依據(jù)。

長白山林蛙輸卵管壁由黏膜上皮、固有層和漿膜構(gòu)成。上皮層細(xì)胞分杯狀細(xì)胞和纖毛上皮細(xì)胞兩種，此階段上皮層以杯狀細(xì)胞為主，多層排列，黏膜下方有一層薄的結(jié)締組織，有少量的微血管和間質(zhì)纖維。固有層主要由單管狀腺構(gòu)成，管狀腺的導(dǎo)管部和分泌部無明顯區(qū)別，無腺腔，腺體細(xì)胞屬開放型細(xì)胞，管狀腺經(jīng)過上皮細(xì)胞突起開口于管腔。冬眠期固有層單管狀腺腺體細(xì)胞內(nèi)都充滿黏液，黏液致密，腺細(xì)胞境界不清，細(xì)胞有融合現(xiàn)象；發(fā)情期當(dāng)卵子通過輸卵管時(shí)，向卵子分泌有效物質(zhì)，將其包裹住，形成卵團(tuán)。最外層為漿膜，為單層結(jié)締組織。

免疫組化結(jié)果顯示，冬眠期固有層單管狀腺腺體細(xì)胞儲(chǔ)存大量黏液，黏液中富含OGP，管狀腺輪廓清晰，呈多邊形，免疫組化呈強(qiáng)陽性，可見棕黃色顆粒狀表達(dá)；黏膜上皮雖有分泌細(xì)胞，但并不含有OGP。發(fā)情期固有層單管狀腺腺體細(xì)胞多數(shù)已分泌黏液，細(xì)胞變成扁平狀，細(xì)胞境界清晰，單管腺結(jié)構(gòu)清晰，可見腺體腺腔，但腺腔內(nèi)仍儲(chǔ)留有黏液，免疫組化呈陽性；OGP經(jīng)黏膜上皮分泌，故在發(fā)情期黏膜上皮細(xì)胞內(nèi)存在少量OGP，免疫組化呈弱陽性。排卵后固有層單管狀腺腺體細(xì)胞的黏液排空，腺體導(dǎo)管部的管腔縮小，細(xì)胞增多，微血管增加，免疫組化呈陰性；黏膜層管腔面不規(guī)則，褶皺變短，似花瓣?duì)?，免疫組化呈陰性。

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Preparation and Application of Polyclonal Antibodies against Oviduct Glucoprotein in Rana Chensinensis Changbaishanensis

CHEN Liang1，LAN Hai-nan2，ZHENG Xin2，LIU Jing-sheng1,*
(1. College of Food Science and Engineering, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China；2. College of Animal Science and Technology, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China)

In order to prepare specific polyclonal antibodies against oviduct glucoprotein (OGP) in Rana Chensinensis Changbaishanensis, the crude fresh OGP-rich extract was purified by Sepharose fast flow anion exchange column and Sephadex G-100 gel column chromatography, and New-Zealand albino rabbits were immunized with the purified OGP for the generation of polyclonal antisera. The purification and identification of the polyclonal antisera obtained were performed using the caprylic acid-saturated ammonium sulfate method. The titer of the purified polyclonal antibodies was measured by enzyme linked immunosorbent assay to be 1:64000, which were characterized by high sensitivity, specificity and titer. Moreover, the polyclonal antibodies prepared in this study were used for the immunohistochemical localization and detection of OGP secreting cells in the oviduct of Rana Chensinensis Changbaishanensis, which was expected to lay an experimental foundation for determining OGP in the culture product of OGP secreting cells.

Rana chensinensis Changbaishanensis；oviduct glucoprotein；antibody；immunohistochemistry

TS201.2；TS218

A

1002-6630(2010)23-0123-05

2010-05-24

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30671536)

陳亮(1982—)，男，碩士研究生，研究方向?yàn)樗a(chǎn)品加工與貯藏。E-mail：6814799@163.com

*通信作者：劉景圣(1964—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)楣δ苄允称?。E-mail：liujs1007@vip.sina.com