羅 強(qiáng)，顏 亮，吳俐莎，張 杰，楊志榮，孫 群*

(四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610065)

印度塊菌水溶性多糖的單糖組成與抗氧化活性研究

羅 強(qiáng)，顏 亮，吳俐莎，張 杰，楊志榮，孫 群*

(四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610065)

采用水提醇沉法對(duì)印度塊菌子實(shí)體水溶性粗多糖進(jìn)行提取，并通過(guò)酶法-Sevag法聯(lián)用脫蛋白，DEAE52纖維素Sephadex G-100柱層析對(duì)其進(jìn)行分離純化，得到主要多糖組分TIP-A。采用高效凝膠滲透色譜(HPGPC)對(duì)其均一性進(jìn)行驗(yàn)證，測(cè)定出相對(duì)分子質(zhì)量(Mr)為17500。氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)分析表明，TIP-A是由D-甘露糖、D-葡萄糖、D-半乳糖、L-鼠李糖組成的均一雜多糖，物質(zhì)的量比約為7:2:2:2。對(duì)TIP-A抗氧化活性研究表明，其對(duì)羥自由基(·OH)、超氧陰離子自由基(O2·)、1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基有較強(qiáng)的清除能力，半抑制質(zhì)量濃度(IC50值)分別為1.06、1.02、1.13mg/mL。對(duì)過(guò)氧化氫(300mmol/L)誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷有較好的抑制力，具備開(kāi)發(fā)成天然抗氧化劑的潛力。

印度塊菌；多糖；單糖組成；抗氧化活性

印度塊菌(Tuber indicum)是一種生長(zhǎng)在森林地表的食藥用真菌，屬子囊菌亞門、塊菌目、塊菌科、塊菌屬，主要分布在中國(guó)的四川和云南兩省，與歐洲的黑孢塊菌在外形上非常相似。作為亞洲著名的黑塊菌，印度塊菌常作為調(diào)味品、香水和化妝品工業(yè)的原料出口歐洲。據(jù)報(bào)道，塊菌中含有豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸、碳水化合物、麥角固醇、甾醇等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和芳香成分[1-2]。另有研究者從中分離出具生物活性的物質(zhì)如α-雄烷醇、神經(jīng)酰胺、塊菌多糖等[3-5]。其中的塊菌多糖具有抗腫瘤，調(diào)節(jié)免疫的作用。

自20世紀(jì)50年代以來(lái)，大量研究表明一些食藥用真菌多糖具有抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤等重要的生物活性，因此食藥用真菌多糖的分離和生物活性研究已逐漸成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)?？寡趸钦婢嗵堑闹匾?/p>

應(yīng)用領(lǐng)域之一，可應(yīng)用在食品、保健品、化妝品等多種產(chǎn)品中。與其他外源性抗氧化劑相比，真菌多糖具有低毒、副作用小、來(lái)源廣等特點(diǎn)。迄今為止對(duì)藥食用真菌多糖研究得比較深入的是香菇、茯苓、靈芝、姬松茸多糖等[6]，未見(jiàn)對(duì)印度塊菌多糖組成分析和抗氧化作用的報(bào)道。

本研究通過(guò)水提醇沉法得到一種印度塊菌中性多糖的粗提物，經(jīng)分離純化后得到均一多糖TIP-A，利用高效凝膠滲透色譜(HPGPC)測(cè)定其相對(duì)分子質(zhì)量，氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)聯(lián)用分析其單糖組成，并對(duì)TIP-A進(jìn)行羥自由基(·OH)，超氧陰離子自由基(O2·)，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基清除能力測(cè)定和體外過(guò)氧化氫誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷的抗氧化活性研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮印度塊菌子實(shí)體(采集自四川省攀枝花市，海拔1300～1800m)由攀枝花農(nóng)林科學(xué)院鑒定為印度塊菌(Tuber indicum Cooke et Massee)。PC12 細(xì)胞株由中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞生理研究所提供，保存于液氮中。

DEAE-cellulose 52、Sephadex G-100 (Phamacia 進(jìn)口分裝) 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；D-阿拉伯糖(DAra)、D-半乳糖(D-Gal)、D-木糖(D-Xyl)、L-鼠李糖(L-Rha)、D-甘露糖(D-Man)、D-葡萄糖(D-Glu)、D-山梨糖(D-Sor)、1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、四偶氮藍(lán)(NBT)、吩嗪硫酸甲酯(PMS)、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)、硫代巴比妥酸(TBA)、二丁基羥基甲苯(BHT)、標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖T500、T-100、T-70、T-10 Sigma公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV2450紫外分光光度計(jì)、GCMS-QP2010氣相色譜日本島津公司；Waters 2695高效凝膠滲透色譜 美國(guó)Waters公司；Bio-Rad imark酶標(biāo)儀 美國(guó)伯樂(lè)公司。

1.3 方法

1.3.1 印度塊菌多糖的提取、分離、純化

新鮮印度塊菌子實(shí)體切片凍干后粉碎成粉末狀，取200g，用濾紙包好，放入索氏提取器，用500mL 95%乙醇反復(fù)抽提8h，除去酚類色素、脂類、單糖等醇溶性物質(zhì)，晾干備用。

上述經(jīng)乙醇提取后的塊菌干粉，加入2L雙蒸水，于80℃浸提4h，抽濾得提取液，重復(fù)3次。合并3次抽濾液，60℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至1L。采用酶解-Sevag法聯(lián)用脫蛋白。取脫蛋白后的粗多糖液2mL，雙氧水脫色，在紫外分光光度計(jì)400～200nm波長(zhǎng)掃描，以檢查蛋白是否除盡。將除去游離蛋白的粗多糖液濃縮至500mL，加入4倍體積的無(wú)水乙醇，4℃過(guò)夜沉淀，10000 r/min離心，沉淀分別用無(wú)水乙醇、丙酮、石油醚洗滌各3次，冷凍干燥得粗多糖。

將粗多糖溶于適量雙蒸水中，用DEAE 52纖維素(2.6cm × 50cm)陰離子交換柱層析分離，0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mol/L NaCl溶液梯度洗脫，流速約為2.5mL/min，每管5mL。0mol/L NaCl 洗脫得到單一組分，命名為TIP，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至小體積，透析脫鹽，凍干。將TIP用適量雙蒸水溶解，用Sephadex G-100(1.6cm×50cm)分子篩層析進(jìn)一步分離純化，以雙蒸水洗脫，流速為2mL/min，每管5mL。得到主要組分TIP-A，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至小體積，透析脫鹽，凍干。以上層析過(guò)程，以自動(dòng)分部收集器收集，苯酚-硫酸法測(cè)定[7]。

1.3.2 印度塊菌多糖主要組分的相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定和單糖組成分析

TIP-A的相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定采用高效凝膠滲透色譜法[8]。以標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖T-500、T-110、T-70、T-40和 T-10建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過(guò)與樣品保留時(shí)間的計(jì)算得出相對(duì)分子質(zhì)量。

多糖的完全酸水解和衍生化：TIP-A 10mg，2.0mol/mL三氟乙酸(TFA) 2mL 于安瓿瓶中，封管120℃水解8h，冷卻后減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去TFA，再加入1.5mL甲醇溶解，減壓蒸干，重復(fù)3次，除盡T F A。向已水解的樣品中加入2mL 吡啶、2mL六甲基二硅氮烷和1mL三甲基氯硅烷。此反應(yīng)體系在50℃ 溫育20min，10000r/min離心20min，上清液進(jìn)樣GC-MS分析。標(biāo)準(zhǔn)單糖混合樣品按上述方法衍生后進(jìn)樣。GC-MS條件參照文獻(xiàn)[9]。1.3.3多糖對(duì)自由基清除力測(cè)定

羥自由基清除力測(cè)定方法參照文獻(xiàn)[10]。以BHT為陽(yáng)性對(duì)照。

式中：Ac為空白對(duì)照(未加樣品)的吸光度；As為加入樣品溶液后反應(yīng)體系的吸光度；As-blank為樣品液的吸光度。

超氧陰離子自由基清除力測(cè)定采用NADH-NBT-PMS體系，方法參照文獻(xiàn)[11]。以BHT為陽(yáng)性對(duì)照。

式中：Ac為空白對(duì)照(未加樣品)的吸光度；As為加入樣品溶液后反應(yīng)體系的吸光度；As-blank為樣品液的吸光度。

DPPH自由基清除力測(cè)定按參考文獻(xiàn)[12]。以BHT作為陽(yáng)性對(duì)照。

式中：Ac為空白對(duì)照(未加樣品)的吸光度；As為加入樣品溶液后反應(yīng)體系的吸光度；As-blank為樣品液的吸光度。

1.3.4 PC12細(xì)胞的培養(yǎng)和塊菌多糖對(duì)過(guò)氧化氫誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷抑制活力測(cè)定

PC12細(xì)胞采用DMEM培養(yǎng)基37℃含二氧化碳培養(yǎng)箱(5% CO2)中進(jìn)行培養(yǎng)。過(guò)氧化氫誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷抑制活力測(cè)定參考文獻(xiàn)[13]。

式中：As為加入樣品溶液和過(guò)氧化氫溶液反應(yīng)液的吸光度；A0為空白對(duì)照和過(guò)氧化氫溶液反應(yīng)液的吸光度；A為過(guò)氧化氫溶液的吸光度。

1.3.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)Oringin 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，并使用該軟件使用線性擬合法計(jì)算出IC50值。

2 結(jié)果與分析

2.1 印度塊菌多糖主要組分TIP-A的分離純化

圖1 印度塊菌水溶性多糖的層析圖譜Fig.1 Chromatogram of water-soluble polysaccharide fromT. indicum

由圖1a可知，經(jīng)DEAE52 纖維素陰離子交換柱層析分級(jí)、脫色，0mol/L NaCl溶液(即雙蒸水)洗脫下來(lái)的中性水溶性多糖主要為TIP，將主要出峰段收集起來(lái)，旋蒸、透析、凍干。后面有一小峰，可能是層析中的拖尾現(xiàn)象，因此未收集。由圖1 b可知，經(jīng)Sephadex G-100 分子篩柱層析純化，TIP-A是印度塊菌水溶性多糖的主要組成成分，因此對(duì)TIP-A進(jìn)行進(jìn)一步的成分和抗氧化活性分析。

2.2 TIP-A相對(duì)分子質(zhì)量、單糖組成

圖2 高效凝膠滲透色譜層析圖譜Fig.2 Chromatogram of TIP-A from high performance gel permeation chromatography (HPGPC)

通過(guò)高效凝膠滲透色譜(HPGPC)對(duì)TIP-A的分析，結(jié)果顯示為單一對(duì)稱峰(圖2)，表明其為均一多糖。根據(jù)TIP-A和標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖保留時(shí)間的比較，利用HPGPC自帶軟件積分計(jì)算出TIP-A的相對(duì)分子質(zhì)量(Mr)約為17500。

圖3 標(biāo)準(zhǔn)單糖混合物氣相色譜圖(A)與TIP-A完全酸水解產(chǎn)物氣相色譜圖(B)Fig.3 Gas chromatogram of standard monosaccharide mixture, and monosaccharide compositions in complete acid hydrolysis products of TIP-A

將TIP-A完全酸水解后的產(chǎn)物硅烷化衍生，經(jīng)GCMS分析，將樣品出峰與標(biāo)準(zhǔn)單糖出峰的相對(duì)保留時(shí)間和質(zhì)譜結(jié)果進(jìn)行比對(duì)。由圖3可知，塊菌多糖TIP-A由 4種單糖組成，分別是D-甘露糖、D-葡萄糖、D-半乳糖、L-鼠李糖，物質(zhì)的量比約為7:2:2:2。

上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證了分離純化得到的印度塊菌多糖

的主要水溶性組分TIP-A的純度與均一性，并證明其是由D-甘露糖、D-葡萄糖、D-半乳糖、L-鼠李糖4種單糖組成的雜多糖。

2.3 多糖抗氧化性分析結(jié)果

2.3.1 TIP-A對(duì)羥自由基的清除力

羥自由基是對(duì)機(jī)體有害的活性氧簇的一種，其化學(xué)性質(zhì)非常活潑，毒性很大，幾乎能與細(xì)胞內(nèi)的每一類有機(jī)物發(fā)生反應(yīng)，因此機(jī)體中及時(shí)消除羥自由基，防止過(guò)量積累對(duì)保護(hù)細(xì)胞非常重要[14]。對(duì)不同質(zhì)量濃度的塊菌多糖TIP-A溶液進(jìn)行清除羥自由基能力測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 TIP-A對(duì)羥自由基的清除作用Fig.4 Scavenging effect of TIP-A on hydroxyl free radicals

圖4表明，隨著多糖質(zhì)量濃度的增大，TIP-A對(duì)羥自由基的清除能力逐漸增大，羥自由基的清除能力與多糖質(zhì)量濃度呈劑量依賴性。隨著多糖質(zhì)量濃度逐漸升高到3、3.5、4mg/mL，對(duì)應(yīng)的清除率經(jīng)顯著性差異分析，差異不顯著(P≥0.05)，羥自由基清除率對(duì)多糖質(zhì)量濃度的劑量依賴性降低，這可能是由于多糖羥自由基清除率隨質(zhì)量濃度升高達(dá)到飽和狀態(tài)造成的。當(dāng)多糖質(zhì)量濃度達(dá)到4mg/mL時(shí)，其清除率為83.13%，與1.5mg/mL的BHT的清除能力相當(dāng)。塊菌多糖TIP-A對(duì)羥自由基的IC50值為1.06mg/mL，與陽(yáng)性對(duì)照BHT對(duì)羥自由基IC50值 0.5mg/mL相比較高。I C50值越小說(shuō)明清除力越強(qiáng)，說(shuō)明塊菌多糖TIP-A對(duì)羥自由基清除力比BHT低，但仍有很好的效果。

2.3.2 TIP-A對(duì)超氧陰離子自由基的清除力

超氧陰離子自由基的過(guò)量積累會(huì)導(dǎo)致生物體損傷，從而間接的引起風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和老年癡呆癥等疾病，機(jī)體中超氧陰離子量的控制是十分重要的[15]。在NADHNBT-PMS體系中，不同質(zhì)量濃度的塊菌多糖TIP-A溶液的超氧陰離子自由基清除能力見(jiàn)圖5。

圖5 TIP-A對(duì)超氧陰離子自由基的清除力Fig.5 Scavenging effect of TIP-A on superoxide anion free radicals

由圖5可知，隨著TIP-A質(zhì)量濃度的增加，其對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力逐漸增強(qiáng)。當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到4mg/mL時(shí)，其清除率最大為75.01%，僅比1.5mg/mL的BHT的清除能力低7%。塊菌多糖TIP-A對(duì)超氧陰離子自由基的IC50值為1.02mg/mL，BHT 的IC50值0.49mg/mL，說(shuō)明TIP-A對(duì)超氧陰離子自由基的清除力比BHT低。

2.3.3 TIP-A對(duì)DPPH自由基的清除力

DPPH是一種穩(wěn)定的芳香類自由基，天然抗氧化物質(zhì)對(duì)DPPH的清除能力被認(rèn)為是抗氧化物質(zhì)清除自由基的總能力[16]。紫紅色DPPH醇溶液在517nm波長(zhǎng)處具有強(qiáng)的特征吸收峰，當(dāng)存在自由基清除劑時(shí)，由于與其單電子配對(duì)而使其吸收逐漸消失，由紫色轉(zhuǎn)變成淡黃色，其褪色程度與其所接受的單電子數(shù)量成定量關(guān)系，因而可以用分光光度法進(jìn)行定量分析[17]。

圖6 TIP-A對(duì)DPPH自由基的清除力Fig.6 Scavenging effect of TIP-A on DPPH free radicals

由圖6可知，在實(shí)驗(yàn)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，清除率隨著多糖質(zhì)量濃度的增大而增大。當(dāng)多糖質(zhì)量濃度達(dá)到4mg/mL時(shí)，清除率為74.49%。塊菌多糖TIP-A對(duì)DPPH自由基的IC50值為1.13mg/mL，BHT 的IC50值為0.59mg/mL，說(shuō)明TIP-A對(duì)自由基清除的總能力雖然比陽(yáng)性對(duì)照BHT低，但效果顯著。

2.3.4 TIP-A對(duì)過(guò)氧化氫誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷抑制活力通過(guò)MTT細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，測(cè)定了TIP-A對(duì)過(guò)氧化氫誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷抑制活力。有研究表明過(guò)氧化氫加入培養(yǎng)PC12細(xì)胞的培養(yǎng)基中，會(huì)引起PC12細(xì)胞的凋亡[18]。

圖7 TIP-A對(duì)過(guò)氧化氫誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷抑制活力Fig.7 Inhibitory effect of TIP-A on PC12 cell damage caused by hydrogen peroxide

由圖7可知，在陰性對(duì)照(無(wú)TIP-A加入)中，細(xì)胞全部死亡。加入多糖溶液在終質(zhì)量濃度分別為5 0、100、200、400、800μg/mL時(shí)，相應(yīng)的損傷抑制率分別為7.6%、19.4%、35.4%、57.9%、71.5%。因此經(jīng)TIP-A預(yù)處理的PC12細(xì)胞的生存活力對(duì)TIP-A質(zhì)量濃度有一定的劑量依賴性。TIP-A對(duì)過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡有較好的抑制作用，提示TIP-A 具有開(kāi)發(fā)為抗氧化應(yīng)激誘導(dǎo)凋亡的神經(jīng)保護(hù)劑的潛力。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)采用水提醇沉法提取塊菌多糖，通過(guò)柱層析進(jìn)一步分離純化，得到印度塊菌多糖TIP-A。經(jīng)高效凝膠滲透色譜分析，驗(yàn)證了TIP-A的均一性，測(cè)定相對(duì)分子質(zhì)量(Mr)為17500。TIP-A完全酸水解產(chǎn)物經(jīng)GC-MS分析證實(shí)由D-甘露糖，D-葡萄糖，D-半乳糖，L-鼠李糖組成，物質(zhì)的量比約為7:2:2:2。

塊菌多糖對(duì)羥自由基、超氧陰離子自由基和DPPH自由基都具有一定的清除能力，并隨著塊菌多糖質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng)，塊菌多糖的IC50值分別是1.06、1.02、1.13mg/mL。對(duì)不同質(zhì)量濃度的TIP-A抑制過(guò)氧化氫誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷的活力測(cè)定結(jié)果顯示出：經(jīng)不同TIP-A質(zhì)量濃度預(yù)處理的PC12細(xì)胞，受到過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的損傷程度與多糖質(zhì)量濃度成負(fù)相關(guān)，損傷抑制率與多糖質(zhì)量濃度成正相關(guān)，顯示出劑量依賴性。因此，印度塊菌多糖具有較強(qiáng)的抗氧化活性，具備開(kāi)發(fā)成為天然抗氧化劑的潛力，有望作為高效、低毒、無(wú)副作用的天然抗氧化劑添加到保健食品、化妝品中，本研究為其應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。還需要進(jìn)一步深入研究TIP-A的分子結(jié)構(gòu)，探究其分子結(jié)構(gòu)與抗氧化性之間的關(guān)系與抗氧化機(jī)制。

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Monosaccharide Compositions and Antioxidant Activity of Water-soluble Polysaccharide Isolated from Tuber indicum

LUO Qiang，YAN Liang，WU Li-sha，ZHANG Jie，YANG Zhi-rong，SUN Qun*
(Key Laboratory of Bio-Resource and Eco-environment, Ministry of Education, College of Life Sciences, Sichuan University, Chengdu 610065, China)

A water-soluble crude polysaccharide was extracted from Truffle (Tuber indicum) by water extraction and alcohol precipitation and then purified by DEAE 52 cellulose and Sephadex G-100 chromatographic column to obtain a major fraction of polysaccharide (TIP-A). The relative molecular weight (Mr) of TIP-A was determined to be 17500 by high performance gel permeation chromatography (HPGPC). In addition, gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) analysis exhibited that TIP-A was a homogeneous heteropolysaccharide consisted of mannose, glucose, galactose and rhamannose with a molar ratio of 7:2:2:2. TIP-A had strong scavenging activity on hydroxyl, superoxide anion, and 1-diphenyl-2-picryldydrazyl (DPPH) free radicals and IC50values of TIP-A for three kinds of free radicals were 1.06, 1.02 mg/mL and 1.13 mg/mL, respectively. TIP-A could also significantly attenuate PC12 cell damage caused by hydrogen peroxide at the concentration of 300 mmol/L.

Tuber indicum；polysaccharide；monosaccharide composition；antioxidant activity

Q539；TS201.1

A

1002-6630(2010)23-0052-05

2010-09-06

“十一五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2006BAD27B09；2006BAD04A12)；國(guó)家“863”計(jì)劃項(xiàng)目(2007AA10Z320)

羅強(qiáng)(1985—)，男，博士研究生，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物分離純化、結(jié)構(gòu)與生物活性。 E-mail：killroy@163.com

*通信作者：孫群(1967—)，女，教授，博士，研究方向?yàn)槲⑸锷锛夹g(shù)。E-mail：qunsun@scu.edu.cn