羅 強(qiáng),顏 亮,吳俐莎,張 杰,楊志榮,孫 群*
(四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,四川 成都 610065)
印度塊菌水溶性多糖的單糖組成與抗氧化活性研究
羅 強(qiáng),顏 亮,吳俐莎,張 杰,楊志榮,孫 群*
(四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,四川 成都 610065)
采用水提醇沉法對(duì)印度塊菌子實(shí)體水溶性粗多糖進(jìn)行提取,并通過(guò)酶法-Sevag法聯(lián)用脫蛋白,DEAE52纖維素Sephadex G-100柱層析對(duì)其進(jìn)行分離純化,得到主要多糖組分TIP-A。采用高效凝膠滲透色譜(HPGPC)對(duì)其均一性進(jìn)行驗(yàn)證,測(cè)定出相對(duì)分子質(zhì)量(Mr)為17500。氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)分析表明,TIP-A是由D-甘露糖、D-葡萄糖、D-半乳糖、L-鼠李糖組成的均一雜多糖,物質(zhì)的量比約為7:2:2:2。對(duì)TIP-A抗氧化活性研究表明,其對(duì)羥自由基(·OH)、超氧陰離子自由基(O2·)、1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基有較強(qiáng)的清除能力,半抑制質(zhì)量濃度(IC50值)分別為1.06、1.02、1.13mg/mL。對(duì)過(guò)氧化氫(300mmol/L)誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷有較好的抑制力,具備開(kāi)發(fā)成天然抗氧化劑的潛力。
印度塊菌;多糖;單糖組成;抗氧化活性
印度塊菌(Tuber indicum)是一種生長(zhǎng)在森林地表的食藥用真菌,屬子囊菌亞門、塊菌目、塊菌科、塊菌屬,主要分布在中國(guó)的四川和云南兩省,與歐洲的黑孢塊菌在外形上非常相似。作為亞洲著名的黑塊菌,印度塊菌常作為調(diào)味品、香水和化妝品工業(yè)的原料出口歐洲。據(jù)報(bào)道,塊菌中含有豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸、碳水化合物、麥角固醇、甾醇等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和芳香成分[1-2]。另有研究者從中分離出具生物活性的物質(zhì)如α-雄烷醇、神經(jīng)酰胺、塊菌多糖等[3-5]。其中的塊菌多糖具有抗腫瘤,調(diào)節(jié)免疫的作用。
自20世紀(jì)50年代以來(lái),大量研究表明一些食藥用真菌多糖具有抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤等重要的生物活性,因此食藥用真菌多糖的分離和生物活性研究已逐漸成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)??寡趸钦婢嗵堑闹匾?/p>
應(yīng)用領(lǐng)域之一,可應(yīng)用在食品、保健品、化妝品等多種產(chǎn)品中。與其他外源性抗氧化劑相比,真菌多糖具有低毒、副作用小、來(lái)源廣等特點(diǎn)。迄今為止對(duì)藥食用真菌多糖研究得比較深入的是香菇、茯苓、靈芝、姬松茸多糖等[6],未見(jiàn)對(duì)印度塊菌多糖組成分析和抗氧化作用的報(bào)道。
本研究通過(guò)水提醇沉法得到一種印度塊菌中性多糖的粗提物,經(jīng)分離純化后得到均一多糖TIP-A,利用高效凝膠滲透色譜(HPGPC)測(cè)定其相對(duì)分子質(zhì)量,氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)聯(lián)用分析其單糖組成,并對(duì)TIP-A進(jìn)行羥自由基(·OH),超氧陰離子自由基(O2·),1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基清除能力測(cè)定和體外過(guò)氧化氫誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷的抗氧化活性研究。
1.1 材料與試劑
新鮮印度塊菌子實(shí)體(采集自四川省攀枝花市,海拔1300~1800m)由攀枝花農(nóng)林科學(xué)院鑒定為印度塊菌(Tuber indicum Cooke et Massee)。PC12 細(xì)胞株由中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞生理研究所提供,保存于液氮中。
DEAE-cellulose 52、Sephadex G-100 (Phamacia 進(jìn)口分裝) 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;D-阿拉伯糖(DAra)、D-半乳糖(D-Gal)、D-木糖(D-Xyl)、L-鼠李糖(L-Rha)、D-甘露糖(D-Man)、D-葡萄糖(D-Glu)、D-山梨糖(D-Sor)、1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、四偶氮藍(lán)(NBT)、吩嗪硫酸甲酯(PMS)、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)、硫代巴比妥酸(TBA)、二丁基羥基甲苯(BHT)、標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖T500、T-100、T-70、T-10 Sigma公司;其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。
1.2 儀器與設(shè)備
UV2450紫外分光光度計(jì)、GCMS-QP2010氣相色譜日本島津公司;Waters 2695高效凝膠滲透色譜 美國(guó)Waters公司;Bio-Rad imark酶標(biāo)儀 美國(guó)伯樂(lè)公司。
1.3 方法
1.3.1 印度塊菌多糖的提取、分離、純化
新鮮印度塊菌子實(shí)體切片凍干后粉碎成粉末狀,取200g,用濾紙包好,放入索氏提取器,用500mL 95%乙醇反復(fù)抽提8h,除去酚類色素、脂類、單糖等醇溶性物質(zhì),晾干備用。
上述經(jīng)乙醇提取后的塊菌干粉,加入2L雙蒸水,于80℃浸提4h,抽濾得提取液,重復(fù)3次。合并3次抽濾液,60℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至1L。采用酶解-Sevag法聯(lián)用脫蛋白。取脫蛋白后的粗多糖液2mL,雙氧水脫色,在紫外分光光度計(jì)400~200nm波長(zhǎng)掃描,以檢查蛋白是否除盡。將除去游離蛋白的粗多糖液濃縮至500mL,加入4倍體積的無(wú)水乙醇,4℃過(guò)夜沉淀,10000 r/min離心,沉淀分別用無(wú)水乙醇、丙酮、石油醚洗滌各3次,冷凍干燥得粗多糖。
將粗多糖溶于適量雙蒸水中,用DEAE 52纖維素(2.6cm × 50cm)陰離子交換柱層析分離,0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mol/L NaCl溶液梯度洗脫,流速約為2.5mL/min,每管5mL。0mol/L NaCl 洗脫得到單一組分,命名為TIP,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至小體積,透析脫鹽,凍干。將TIP用適量雙蒸水溶解,用Sephadex G-100(1.6cm×50cm)分子篩層析進(jìn)一步分離純化,以雙蒸水洗脫,流速為2mL/min,每管5mL。得到主要組分TIP-A,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至小體積,透析脫鹽,凍干。以上層析過(guò)程,以自動(dòng)分部收集器收集,苯酚-硫酸法測(cè)定[7]。
1.3.2 印度塊菌多糖主要組分的相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定和單糖組成分析
TIP-A的相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定采用高效凝膠滲透色譜法[8]。以標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖T-500、T-110、T-70、T-40和 T-10建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,通過(guò)與樣品保留時(shí)間的計(jì)算得出相對(duì)分子質(zhì)量。
多糖的完全酸水解和衍生化:TIP-A 10mg,2.0mol/mL三氟乙酸(TFA) 2mL 于安瓿瓶中,封管120℃水解8h,冷卻后減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去TFA,再加入1.5mL甲醇溶解,減壓蒸干,重復(fù)3次,除盡T F A。向已水解的樣品中加入2mL 吡啶、2mL六甲基二硅氮烷和1mL三甲基氯硅烷。此反應(yīng)體系在50℃ 溫育20min,10000r/min離心20min,上清液進(jìn)樣GC-MS分析。標(biāo)準(zhǔn)單糖混合樣品按上述方法衍生后進(jìn)樣。GC-MS條件參照文獻(xiàn)[9]。1.3.3多糖對(duì)自由基清除力測(cè)定
羥自由基清除力測(cè)定方法參照文獻(xiàn)[10]。以BHT為陽(yáng)性對(duì)照。
式中:Ac為空白對(duì)照(未加樣品)的吸光度;As為加入樣品溶液后反應(yīng)體系的吸光度;As-blank為樣品液的吸光度。
超氧陰離子自由基清除力測(cè)定采用NADH-NBT-PMS體系,方法參照文獻(xiàn)[11]。以BHT為陽(yáng)性對(duì)照。
式中:Ac為空白對(duì)照(未加樣品)的吸光度;As為加入樣品溶液后反應(yīng)體系的吸光度;As-blank為樣品液的吸光度。
DPPH自由基清除力測(cè)定按參考文獻(xiàn)[12]。以BHT作為陽(yáng)性對(duì)照。
式中:Ac為空白對(duì)照(未加樣品)的吸光度;As為加入樣品溶液后反應(yīng)體系的吸光度;As-blank為樣品液的吸光度。
1.3.4 PC12細(xì)胞的培養(yǎng)和塊菌多糖對(duì)過(guò)氧化氫誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷抑制活力測(cè)定
PC12細(xì)胞采用DMEM培養(yǎng)基37℃含二氧化碳培養(yǎng)箱(5% CO2)中進(jìn)行培養(yǎng)。過(guò)氧化氫誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷抑制活力測(cè)定參考文獻(xiàn)[13]。
式中:As為加入樣品溶液和過(guò)氧化氫溶液反應(yīng)液的吸光度;A0為空白對(duì)照和過(guò)氧化氫溶液反應(yīng)液的吸光度;A為過(guò)氧化氫溶液的吸光度。
1.3.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析
實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)Oringin 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,并使用該軟件使用線性擬合法計(jì)算出IC50值。
2.1 印度塊菌多糖主要組分TIP-A的分離純化
圖1 印度塊菌水溶性多糖的層析圖譜Fig.1 Chromatogram of water-soluble polysaccharide fromT. indicum
由圖1a可知,經(jīng)DEAE52 纖維素陰離子交換柱層析分級(jí)、脫色,0mol/L NaCl溶液(即雙蒸水)洗脫下來(lái)的中性水溶性多糖主要為TIP,將主要出峰段收集起來(lái),旋蒸、透析、凍干。后面有一小峰,可能是層析中的拖尾現(xiàn)象,因此未收集。由圖1 b可知,經(jīng)Sephadex G-100 分子篩柱層析純化,TIP-A是印度塊菌水溶性多糖的主要組成成分,因此對(duì)TIP-A進(jìn)行進(jìn)一步的成分和抗氧化活性分析。
2.2 TIP-A相對(duì)分子質(zhì)量、單糖組成
圖2 高效凝膠滲透色譜層析圖譜Fig.2 Chromatogram of TIP-A from high performance gel permeation chromatography (HPGPC)
通過(guò)高效凝膠滲透色譜(HPGPC)對(duì)TIP-A的分析,結(jié)果顯示為單一對(duì)稱峰(圖2),表明其為均一多糖。根據(jù)TIP-A和標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖保留時(shí)間的比較,利用HPGPC自帶軟件積分計(jì)算出TIP-A的相對(duì)分子質(zhì)量(Mr)約為17500。
圖3 標(biāo)準(zhǔn)單糖混合物氣相色譜圖(A)與TIP-A完全酸水解產(chǎn)物氣相色譜圖(B)Fig.3 Gas chromatogram of standard monosaccharide mixture, and monosaccharide compositions in complete acid hydrolysis products of TIP-A
將TIP-A完全酸水解后的產(chǎn)物硅烷化衍生,經(jīng)GCMS分析,將樣品出峰與標(biāo)準(zhǔn)單糖出峰的相對(duì)保留時(shí)間和質(zhì)譜結(jié)果進(jìn)行比對(duì)。由圖3可知,塊菌多糖TIP-A由 4種單糖組成,分別是D-甘露糖、D-葡萄糖、D-半乳糖、L-鼠李糖,物質(zhì)的量比約為7:2:2:2。
上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證了分離純化得到的印度塊菌多糖
的主要水溶性組分TIP-A的純度與均一性,并證明其是由D-甘露糖、D-葡萄糖、D-半乳糖、L-鼠李糖4種單糖組成的雜多糖。
2.3 多糖抗氧化性分析結(jié)果
2.3.1 TIP-A對(duì)羥自由基的清除力
羥自由基是對(duì)機(jī)體有害的活性氧簇的一種,其化學(xué)性質(zhì)非常活潑,毒性很大,幾乎能與細(xì)胞內(nèi)的每一類有機(jī)物發(fā)生反應(yīng),因此機(jī)體中及時(shí)消除羥自由基,防止過(guò)量積累對(duì)保護(hù)細(xì)胞非常重要[14]。對(duì)不同質(zhì)量濃度的塊菌多糖TIP-A溶液進(jìn)行清除羥自由基能力測(cè)定,結(jié)果見(jiàn)圖4。
圖4 TIP-A對(duì)羥自由基的清除作用Fig.4 Scavenging effect of TIP-A on hydroxyl free radicals
圖4表明,隨著多糖質(zhì)量濃度的增大,TIP-A對(duì)羥自由基的清除能力逐漸增大,羥自由基的清除能力與多糖質(zhì)量濃度呈劑量依賴性。隨著多糖質(zhì)量濃度逐漸升高到3、3.5、4mg/mL,對(duì)應(yīng)的清除率經(jīng)顯著性差異分析,差異不顯著(P≥0.05),羥自由基清除率對(duì)多糖質(zhì)量濃度的劑量依賴性降低,這可能是由于多糖羥自由基清除率隨質(zhì)量濃度升高達(dá)到飽和狀態(tài)造成的。當(dāng)多糖質(zhì)量濃度達(dá)到4mg/mL時(shí),其清除率為83.13%,與1.5mg/mL的BHT的清除能力相當(dāng)。塊菌多糖TIP-A對(duì)羥自由基的IC50值為1.06mg/mL,與陽(yáng)性對(duì)照BHT對(duì)羥自由基IC50值 0.5mg/mL相比較高。I C50值越小說(shuō)明清除力越強(qiáng),說(shuō)明塊菌多糖TIP-A對(duì)羥自由基清除力比BHT低,但仍有很好的效果。
2.3.2 TIP-A對(duì)超氧陰離子自由基的清除力
超氧陰離子自由基的過(guò)量積累會(huì)導(dǎo)致生物體損傷,從而間接的引起風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和老年癡呆癥等疾病,機(jī)體中超氧陰離子量的控制是十分重要的[15]。在NADHNBT-PMS體系中,不同質(zhì)量濃度的塊菌多糖TIP-A溶液的超氧陰離子自由基清除能力見(jiàn)圖5。
圖5 TIP-A對(duì)超氧陰離子自由基的清除力Fig.5 Scavenging effect of TIP-A on superoxide anion free radicals
由圖5可知,隨著TIP-A質(zhì)量濃度的增加,其對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力逐漸增強(qiáng)。當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到4mg/mL時(shí),其清除率最大為75.01%,僅比1.5mg/mL的BHT的清除能力低7%。塊菌多糖TIP-A對(duì)超氧陰離子自由基的IC50值為1.02mg/mL,BHT 的IC50值0.49mg/mL,說(shuō)明TIP-A對(duì)超氧陰離子自由基的清除力比BHT低。
2.3.3 TIP-A對(duì)DPPH自由基的清除力
DPPH是一種穩(wěn)定的芳香類自由基,天然抗氧化物質(zhì)對(duì)DPPH的清除能力被認(rèn)為是抗氧化物質(zhì)清除自由基的總能力[16]。紫紅色DPPH醇溶液在517nm波長(zhǎng)處具有強(qiáng)的特征吸收峰,當(dāng)存在自由基清除劑時(shí),由于與其單電子配對(duì)而使其吸收逐漸消失,由紫色轉(zhuǎn)變成淡黃色,其褪色程度與其所接受的單電子數(shù)量成定量關(guān)系,因而可以用分光光度法進(jìn)行定量分析[17]。
圖6 TIP-A對(duì)DPPH自由基的清除力Fig.6 Scavenging effect of TIP-A on DPPH free radicals
由圖6可知,在實(shí)驗(yàn)質(zhì)量濃度范圍內(nèi),清除率隨著多糖質(zhì)量濃度的增大而增大。當(dāng)多糖質(zhì)量濃度達(dá)到4mg/mL時(shí),清除率為74.49%。塊菌多糖TIP-A對(duì)DPPH自由基的IC50值為1.13mg/mL,BHT 的IC50值為0.59mg/mL,說(shuō)明TIP-A對(duì)自由基清除的總能力雖然比陽(yáng)性對(duì)照BHT低,但效果顯著。
2.3.4 TIP-A對(duì)過(guò)氧化氫誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷抑制活力通過(guò)MTT細(xì)胞實(shí)驗(yàn),測(cè)定了TIP-A對(duì)過(guò)氧化氫誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷抑制活力。有研究表明過(guò)氧化氫加入培養(yǎng)PC12細(xì)胞的培養(yǎng)基中,會(huì)引起PC12細(xì)胞的凋亡[18]。
圖7 TIP-A對(duì)過(guò)氧化氫誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷抑制活力Fig.7 Inhibitory effect of TIP-A on PC12 cell damage caused by hydrogen peroxide
由圖7可知,在陰性對(duì)照(無(wú)TIP-A加入)中,細(xì)胞全部死亡。加入多糖溶液在終質(zhì)量濃度分別為5 0、100、200、400、800μg/mL時(shí),相應(yīng)的損傷抑制率分別為7.6%、19.4%、35.4%、57.9%、71.5%。因此經(jīng)TIP-A預(yù)處理的PC12細(xì)胞的生存活力對(duì)TIP-A質(zhì)量濃度有一定的劑量依賴性。TIP-A對(duì)過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡有較好的抑制作用,提示TIP-A 具有開(kāi)發(fā)為抗氧化應(yīng)激誘導(dǎo)凋亡的神經(jīng)保護(hù)劑的潛力。
本實(shí)驗(yàn)采用水提醇沉法提取塊菌多糖,通過(guò)柱層析進(jìn)一步分離純化,得到印度塊菌多糖TIP-A。經(jīng)高效凝膠滲透色譜分析,驗(yàn)證了TIP-A的均一性,測(cè)定相對(duì)分子質(zhì)量(Mr)為17500。TIP-A完全酸水解產(chǎn)物經(jīng)GC-MS分析證實(shí)由D-甘露糖,D-葡萄糖,D-半乳糖,L-鼠李糖組成,物質(zhì)的量比約為7:2:2:2。
塊菌多糖對(duì)羥自由基、超氧陰離子自由基和DPPH自由基都具有一定的清除能力,并隨著塊菌多糖質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng),塊菌多糖的IC50值分別是1.06、1.02、1.13mg/mL。對(duì)不同質(zhì)量濃度的TIP-A抑制過(guò)氧化氫誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷的活力測(cè)定結(jié)果顯示出:經(jīng)不同TIP-A質(zhì)量濃度預(yù)處理的PC12細(xì)胞,受到過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的損傷程度與多糖質(zhì)量濃度成負(fù)相關(guān),損傷抑制率與多糖質(zhì)量濃度成正相關(guān),顯示出劑量依賴性。因此,印度塊菌多糖具有較強(qiáng)的抗氧化活性,具備開(kāi)發(fā)成為天然抗氧化劑的潛力,有望作為高效、低毒、無(wú)副作用的天然抗氧化劑添加到保健食品、化妝品中,本研究為其應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。還需要進(jìn)一步深入研究TIP-A的分子結(jié)構(gòu),探究其分子結(jié)構(gòu)與抗氧化性之間的關(guān)系與抗氧化機(jī)制。
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Monosaccharide Compositions and Antioxidant Activity of Water-soluble Polysaccharide Isolated from Tuber indicum
LUO Qiang,YAN Liang,WU Li-sha,ZHANG Jie,YANG Zhi-rong,SUN Qun*
(Key Laboratory of Bio-Resource and Eco-environment, Ministry of Education, College of Life Sciences, Sichuan University, Chengdu 610065, China)
A water-soluble crude polysaccharide was extracted from Truffle (Tuber indicum) by water extraction and alcohol precipitation and then purified by DEAE 52 cellulose and Sephadex G-100 chromatographic column to obtain a major fraction of polysaccharide (TIP-A). The relative molecular weight (Mr) of TIP-A was determined to be 17500 by high performance gel permeation chromatography (HPGPC). In addition, gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) analysis exhibited that TIP-A was a homogeneous heteropolysaccharide consisted of mannose, glucose, galactose and rhamannose with a molar ratio of 7:2:2:2. TIP-A had strong scavenging activity on hydroxyl, superoxide anion, and 1-diphenyl-2-picryldydrazyl (DPPH) free radicals and IC50values of TIP-A for three kinds of free radicals were 1.06, 1.02 mg/mL and 1.13 mg/mL, respectively. TIP-A could also significantly attenuate PC12 cell damage caused by hydrogen peroxide at the concentration of 300 mmol/L.
Tuber indicum;polysaccharide;monosaccharide composition;antioxidant activity
Q539;TS201.1
A
1002-6630(2010)23-0052-05
2010-09-06
“十一五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2006BAD27B09;2006BAD04A12);國(guó)家“863”計(jì)劃項(xiàng)目(2007AA10Z320)
羅強(qiáng)(1985—),男,博士研究生,研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物分離純化、結(jié)構(gòu)與生物活性。 E-mail:killroy@163.com
*通信作者:孫群(1967—),女,教授,博士,研究方向?yàn)槲⑸锷锛夹g(shù)。E-mail:qunsun@scu.edu.cn