李穎暢，呂春茂，孟憲軍，馬 勇，馮彥博

(1.渤海大學(xué)生物與食品科學(xué)學(xué)院，遼寧 錦州 121000；2.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 沈陽 110161)

圣云藍(lán)莓果中錦葵色素-3-半乳糖苷的結(jié)構(gòu)鑒定

李穎暢1，呂春茂2，孟憲軍2，馬 勇1，馮彥博1

(1.渤海大學(xué)生物與食品科學(xué)學(xué)院，遼寧 錦州 121000；2.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 沈陽 110161)

采用體積分?jǐn)?shù)60%(pH3.0)的乙醇在恒溫水浴(40℃)條件下提取圣云藍(lán)莓花色苷，將所得濃縮液經(jīng)AB-8大孔樹脂純化，40℃減壓濃縮，真空干燥得到紫黑色粉末，再經(jīng)過制備型高效液相色譜分離獲得單體化合物。經(jīng)紫外光譜、紅外光譜、質(zhì)譜、1H和13C核磁共振、薄層色譜對單體化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，確定此化合物為錦葵色素-3-半乳糖苷。

圣云藍(lán)莓果；結(jié)構(gòu)鑒定；錦葵色素-3-半乳糖苷

藍(lán)莓屬于杜鵑花科(Ericaceae) 越橘屬(Vaccinium. SPP)多年生落葉或常綠灌木[1]。圣云藍(lán)莓屬于半高叢品種，果實扁圓形，呈藍(lán)色，過熟時呈藍(lán)黑色，果粉較少，果肉細(xì)膩，種子極小，果實可溶性固形物含量12.4%。藍(lán)莓果中含有豐富花色苷類物質(zhì)，花色苷對人體健康有益，具有多種生物活性，如抗氧化及清除自由基作用、抗突變活性、抗癌活性、抗炎及抗病毒效果，具有廣闊的應(yīng)用前景[1-4]?；ㄉ諉误w種類很多，但應(yīng)用在食品中的主要有天竺葵色素、矢車菊色素、飛燕草色素、芍藥色素、牽牛花色素和錦葵色素與葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖各自結(jié)合形成的花色苷，且多為單糖和雙糖苷。人們對不同植物所含花色苷的種類、結(jié)構(gòu)的研究報道較多，其分離鑒定的方法也有許多種，如紙層析法分離花色苷元[5]、花色苷的光譜鑒定法[6]。高效液相色譜-質(zhì)譜( HPLC-MS)在目前花色苷鑒定中應(yīng)用最為廣泛[7]，Zhang等[8]利用HPLC-MS聯(lián)用的方法鑒定了荔枝皮中的花色苷，此法克服了HPLC法缺少標(biāo)準(zhǔn)品的缺陷，大大提高了花色苷鑒定的準(zhǔn)確性。有關(guān)圣云藍(lán)莓花色苷單體的化學(xué)結(jié)構(gòu)研究國內(nèi)外尚未見報道，為了進(jìn)一步開發(fā)利用圣云藍(lán)莓，本實驗對圣云藍(lán)莓的主要花色苷單體進(jìn)行分離和結(jié)構(gòu)鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

圣云藍(lán)莓果由沈陽市雙翼果業(yè)生產(chǎn)示范基地提供。

無水乙醇、檸檬酸、檸檬酸鈉、甲酸、三氯化鋁(均為分析純)、甲醇(色譜純) 迪馬公司；AB-8大孔樹脂 天津南開大學(xué)化工廠；自制超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1600型紫外-可見分光光度計 北京瑞利分析儀器公司；PHS-25型酸度計 上海理達(dá)儀器廠；電熱恒溫水浴鍋 常州國華電器有限公司；RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海博通經(jīng)貿(mào)有限公司；SHZ-IIIB型循環(huán)水真空泵上海華琦科學(xué)儀器有限公司；玻璃層析柱(1cm×30cm)

上海青浦滬西儀器廠；DZF-6050型真空干燥箱 上海精宏儀器設(shè)備有限公司； 制備型高效液相色譜儀、質(zhì)譜儀 美國Agilent公司；紅外光譜儀 日本島津公司；電子分析天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；Avatar330型核磁共振儀 美國Nicolet公司。

1.3 方法

1.3.1 圣云藍(lán)莓樣品的制備

將一定量圣云藍(lán)莓果，破碎，用pH3.0的60%乙醇溶液按1:15(m/V)的比例混合均勻，于40℃下浸提2h后抽濾，收集濾液，40℃減壓濃縮得到紅色黏稠粗提液。經(jīng)AB-8大孔樹脂純化，40℃減壓濃縮得到純化的藍(lán)莓花色苷濃縮液，真空干燥得到紫黑色粉末。

1.3.2 圣云藍(lán)莓花色苷單體制備

通過制備型反相高效液相色譜對圣云藍(lán)莓樣品分離，流動相為30%甲醇水溶液(含2.0%的甲酸)，梯度洗脫，流速為10mL/min，制備單體化合物。

1.3.3 圣云藍(lán)莓花色苷單體化合物結(jié)構(gòu)鑒定

1.3.3.1 紫外-可見光譜分析

1)結(jié)合輸電線路停電檢修，對OPGW光纜接續(xù)盒進(jìn)行開盒檢查。檢查光纜接頭盒密封良好，并且無腐蝕、損壞或變形等異常情況，防止由于引入纜封堵不嚴(yán)或接續(xù)盒安裝不正確造成盒內(nèi)進(jìn)水結(jié)冰導(dǎo)致光纖受力引起斷纖故障。同時，做好進(jìn)站光纜及引下線接地方式的優(yōu)化設(shè)計和技術(shù)改造[4-5]。

把藍(lán)莓花色苷單體化合物樣品用0.1%鹽酸甲醇溶液溶解，并用0.1%鹽酸甲醇溶液做參比，用UV1600紫外-可見分光光度計從250～700nm掃描，得到藍(lán)莓花色苷的紫外-可見光譜圖。在藍(lán)莓花色苷甲醇溶液中加AlCl3，觀察最大吸收波長是否發(fā)生位移。

1.3.3.2 紅外光譜分析

取少量藍(lán)莓花色苷單體化合物樣品置于瑪瑙研缽中，再加適量KBr粉末作為載體，研磨后，放入壓片模具中，加壓，3min后取出樣品，放入儀器的樣品槽中，用紅外光譜儀掃描，得到單體化合物的紅外光譜圖。

1.3.3.3 高效液相色譜-質(zhì)譜法

(1)樣品處理

將真空干燥的圣云藍(lán)莓樣品，用含0.1%鹽酸的50%甲醇溶液溶解，配制成質(zhì)量濃度為2.5mg/mL的溶液，用0.45μm的濾膜過濾，收集濾液。

(2)分析條件

Agilent1100型高效液相色譜儀，紫外檢測器，波長：520nm；流動相：A甲醇，B 2.5%甲酸水溶液；分離柱：C18(4.6mm×150mm，5μm)。流速為1mL/min，溫度30℃，梯度洗脫程序為：0～8min，5%～20%A，95%～80%B；8～15min，20%～50%A，80%～50%B；15～20min，50%A，50%B；20～20.01min，50%～5%A，50%～95%B；20.01～25min，5%A，95%B。(3)質(zhì)譜分析

質(zhì)譜條件為毛細(xì)管電流：55nA，電壓：3200V；霧化壓力：2.76×105Pa；離子穩(wěn)定強(qiáng)度100%，N2流速9.0mL/min，掃描范圍為50～1000u。

1.3.3.4 核磁共振分析

分別將樣品用氘代甲醇溶解，采用核磁共振儀作氫譜和碳譜分析，以氘代甲醇為內(nèi)標(biāo)。

1.3.3.5 藍(lán)莓花色苷的糖組成測定[9]

將純化的圣云藍(lán)莓花色苷單體溶于3mol/L的HCl中，在100℃條件下回流水解4～5h，得到棕色溶液，用正戊醇萃取至水層無色，將水層濃縮，得到糖的濃縮液，用薄層層析鑒定糖的組成。配制木糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、果糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，質(zhì)量濃度為1mg/mL，配制一定質(zhì)量濃度的花色苷單體水解后的糖溶液，在距活化過的薄層板下端1.5cm點(diǎn)樣，點(diǎn)間距1.5～2cm。將點(diǎn)好樣品的薄層層析板置于盛有展開劑的層析缸中，密封式展開，展開劑距薄層上端1cm時取出，展開劑為氯仿:冰乙酸:水體積比為30:35:5。將展開過的薄層層析板以吹風(fēng)機(jī)吹干，將顯色劑(苯胺-二苯胺-磷酸)均勻噴灑在薄層層析板上，此板在100℃烘烤10min即可顯色，薄層顯色后，將樣品圖譜與標(biāo)準(zhǔn)圖譜比較，確定樣品中糖的組成。

2 結(jié)果與分析

圖1 圣云藍(lán)莓花色苷單體化合物的紫外-可見光譜圖Fig.1 Ultraviolet-visible spectrum of monomeric compound

2.1 紫外-可見吸收光譜根據(jù)花色苷結(jié)構(gòu)的不同，在可見區(qū)最大吸收峰的位置有很大差異。由圖1可知，圣云藍(lán)莓花色苷單體化合物在甲醇溶液的特征吸收波長分別在279、535nm左右；在300～330nm間沒有吸收峰，說明花色苷分子內(nèi)沒有?；?；向其甲醇溶液中加AlCl3，可見區(qū)的最大吸收峰未向長波方向移動，說明此花色苷B-環(huán)無鄰位酚羥基，因此單體化合物不可能是矢車菊色素、牽牛花色素或飛燕草色素。這一表現(xiàn)與錦葵類花色素的特征吸收相一致[10]。由此可初步推斷其成分可能屬于錦葵類化合物。

2.2 紅外光譜圖分析

圖2 圣云藍(lán)莓花色苷單體化合物的紅外光譜圖Fig.2 Infrared spectrum of monomeric compound

由圖2可知，圣云藍(lán)莓花色苷單體化合物的主要吸收峰有 3425.273、2928.325、1637.583、1595.046、1515.056、1460.647、1383.8051、1346.255、1205.691、1111.701、1068.425cm-1。根據(jù)圖2峰的位置和形狀，并結(jié)合參考文獻(xiàn)[10-12]分析確定， 3425.273cm-1是—OH伸縮振動吸收峰，2928.325cm-1是甲氧基 C-H 伸縮振動吸收峰，1383.805、1346.255cm-1，可能是甲氧基C-H 面內(nèi)彎曲振動吸收峰， 1637.583cm-1可能是C=O 鍵伸縮振動吸收峰，1595.046、1515.056、1460.647cm-1可能是芳烴骨架C=C 鍵伸縮振動吸收峰；1205.691cm-1可能是羥基上的C-O伸縮振動吸收峰；1111.701、1068.425cm-1可能是C-O-C伸縮振動吸收峰。以上這些都是花色苷的特征吸收峰，可見此花色苷單體中有苯環(huán)、羥基、含氧雜環(huán)和甲氧基的特征基團(tuán)，這些基團(tuán)也是黃酮類化合物的特征基團(tuán)，可見此花色苷單體化合物屬于黃酮類物質(zhì)。

2.3 高效液相色譜-質(zhì)譜分析

圖3 圣云藍(lán)莓花色苷單體化合物的一級、二級質(zhì)譜圖Fig.3 [MS]/[MS2] spectrum of monomeric compound

由圖3可知，圣云藍(lán)莓花色苷單體化合物的保留時間為7.5min，峰面積百分比為96.23%。可以看出此物質(zhì)已經(jīng)達(dá)到所需的純度要求。由分子離子峰為492.8(即493)和子離子峰330.8(331)可知，[MS/MS2] m/z 331.0為花色苷脫掉糖殘基后的碎片峰，即錦葵色素配基離子峰，493與331相差162，正好是一個半乳糖或葡萄糖去掉一個H2O之后的相對分子質(zhì)量，確定連接的糖為半乳糖或葡萄糖，因此，此花色苷單體為錦葵色素的半乳糖苷或葡萄糖苷。

2.4 核磁共振譜圖分析

2.5 糖的組成分析

圖4 圣云藍(lán)莓花色苷單體化合物糖組成薄層色譜圖Fig.4 Thin-layer chromatographic pattern showing the soluble sugar composition of monomeric compound

圖5 錦葵色素-3-半乳糖苷結(jié)構(gòu)圖Fig.5 Chemical structure of monomeric compound malvidin-3-galactoside

由圖4可知，薄層色譜中從左到右各單糖依次為木糖、葡萄糖、半乳糖、樣品、阿拉伯糖、果糖。通過樣品和其他單糖標(biāo)準(zhǔn)品對比可以看出，圣云藍(lán)莓花色苷單體化合物中主要是半乳糖。

綜合紫外-可見光譜、紅外光譜、質(zhì)譜、核磁共振、糖薄層色譜分析，推斷單體化合物的主要成分為錦葵色素-3-半乳糖苷，結(jié)構(gòu)見圖5。

3 結(jié) 論

采用制備型高效液相色譜對大孔樹脂純化后的圣云藍(lán)莓花色苷進(jìn)行分離，獲得圣云藍(lán)莓花色苷單體化合物。通過紫外-可見光譜、紅外光譜、高效液相色譜-質(zhì)譜、核磁共振、薄層色譜等方法對圣云藍(lán)莓花色苷單體進(jìn)行鑒定，確定此圣云藍(lán)莓花色苷單體為錦葵色素-3-半乳糖苷。圣云藍(lán)莓果實紅色素主要成分的鑒定對圣云藍(lán)莓的化學(xué)分類及其果實紅色素在食品工業(yè)中的綜合開發(fā)利用具有重要的意義。

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Structural Identification of Malvidin-3-galactoside from St. Cloud Blueberry Fruits

LI Ying-chang1，LU Chun-mao2，MENG Xian-jun2，MA Yong1，F(xiàn)ENG Yan-bo1
(1.College of Biology and Food Science, Bohai University, Jinzhou 121000, China；2.College of Food Science, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110161,China)

The anthocyanins in St. cloud blueberry fruits were extracted with 60% ethanol (pH 3.0) at 40 ℃ and the extract was concentrated, followed by purification with AB-8 macroporous resin and vacuum drying, to obtain a dark purple powder. A monomeric compound was isolated from the powder by preparative high-performance liquid chromatography (HPLC) and identified as malvidin-3-arabinoside by ultraviolet-visible, infrared, mass and nuclear magnetic resource spectroscopy as well as thin layer chromatography. This indicates that St. cloud blueberry fruits are exploitable for further development.

St. cloud blueberry fruits；structural identification；malvidin-3-galactoside

TS264.4

A

1002-6630(2010)23-0014-04

2010-01-19

沈陽市青年人才計劃項目(1081240-1-02)

李穎暢(1973—)，女，副教授，博士，研究方向為天然產(chǎn)物功效成分。E-mail：liyingchangsy@126.com