楊曉梅，鮑隆友，耿向永，蔡靈男

（1.西藏農(nóng)牧學(xué)院動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，西藏林芝，860000；2.西藏農(nóng)牧學(xué)院高原生態(tài)研究所）

西藏野生靈芝粗多糖提取工藝研究

楊曉梅1，鮑隆友1，耿向永2，蔡靈男1

（1.西藏農(nóng)牧學(xué)院動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，西藏林芝，860000；2.西藏農(nóng)牧學(xué)院高原生態(tài)研究所）

采用正交試驗(yàn)，對影響靈芝多糖提取的4個主要因素（料水比、提取溫度、提取時間、醇析濃度）進(jìn)行了最佳工藝條件研究。結(jié)果表明，提取靈芝子實(shí)體粗多糖采用水提醇沉法，最優(yōu)工藝條件為：料水比1∶50，提取溫度90℃，提取2次，每次提取2 h，90%乙醇醇析，3 000 r/min離心30 min取沉淀，sevage法除游離蛋白，離心取上層液即為靈芝粗多糖溶液。苯酚-硫酸法測定靈芝子實(shí)體粗多糖含量約為0.734%，這一含量在全國靈芝子實(shí)體多糖含量中處于中等水平，還有待于進(jìn)一步的研究和開發(fā)利用。

西藏；野生；靈芝；粗多糖；提取

靈芝是我國中醫(yī)藥寶庫中的燦爛瑰寶，幾千年來備受中華民族的珍愛和崇拜。其中靈芝多糖又以其特有的醫(yī)學(xué)功效成為靈芝的主要活性成分，其含量已成為衡量靈芝質(zhì)量的重要指標(biāo)之一[1]。多糖由多種醛糖和酮糖通過糖苷縮合而成，是一種天然多聚體，其分子量從幾百到數(shù)十萬，除一小部分小分子多糖外，大多不溶于高度醇而溶于熱水。根據(jù)多糖的這種化學(xué)特性，靈芝多糖的一般提取過程是：技術(shù)處理→分離純化→含量測定。本試驗(yàn)以西藏野生靈芝（Ganoderma lucidum）為材料，探究在西藏高海拔條件下靈芝粗多糖的提取工藝，以期為西藏野生靈芝的開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 試驗(yàn)材料

新鮮靈芝采自西藏林芝地區(qū)林芝縣、米林縣。試驗(yàn)試劑有葡萄糖（成都化學(xué)試劑廠生產(chǎn)）、濃硫酸（四川省德陽市化學(xué)試劑廠生產(chǎn)）、苯酚（成都化學(xué)試劑廠生產(chǎn)）。儀器設(shè)備有752-紫外分光光度計、萬分之一分析天平、全自動高壓滅菌鍋、水浴鍋。

1.2 試驗(yàn)方法

①靈芝子實(shí)體多糖的提取 將靈芝子實(shí)體表面沖洗干凈后放入烘箱中，50℃烘干至恒質(zhì)量，然后在粉碎機(jī)中以1 400 r/min粉碎3遍，并過直徑為102 mm的網(wǎng)篩得絮狀物，密封于磨口玻璃瓶中干燥保存?zhèn)溆谩?/p>

靈芝子實(shí)體多糖的提取主要采取水溶提取法。根據(jù)前人研究結(jié)果[2～4]選擇料水比、提取溫度、提取時間、醇析濃度4個對提取靈芝多糖影響較大的提取因素分別按單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)方法來確定靈芝粗多糖提取的最優(yōu)工藝方法。

試驗(yàn)采用的提取工藝流程是：稱量→加料液→熱水浸提→過濾→熱水浸提→過濾→（合并2次濾液）醇析（除去單糖、雙糖、低聚糖等成分[5]）→離心（3 000 r/min，離心30 min）取沉淀→sevage法除游離蛋白（取上一步沉淀與sevage液混合并用力振蕩5 min）→離心（3 000 r/min，離心30 min）取上層液，上層液即是靈芝粗多糖溶液，可用于測定。

②多糖含量測定 測定靈芝多糖含量采用苯酚-硫酸法。靈芝粗多糖含量根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸計算。

a.配制標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液。取一定量的葡萄糖放入烘箱中，105℃干燥至恒質(zhì)量，冷卻后，精確稱取10 mg，定容至100 mL，即為0.1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液，4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

b.測定最大吸收波長。精確量取標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液0.5 mL于10 mL具塞試管中，蒸餾水為空白，加水至1 mL，后加入5%苯酚1.0 mL和濃硫酸5.0 mL，迅速振蕩混勻，室溫下放置30 min。取一定量的液體在不同波長下測定吸光度。波長設(shè)定范圍在370～590 nm。

c.繪制標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖曲線。精確量取標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8 mL于10 mL具塞試管中，蒸餾水為空白，加水至1 mL，后加入5%苯酚1.0 mL和濃硫酸5.0 mL，迅速振蕩混勻，室溫下放置30 min。取一定量的液體在最大吸收波長下測定吸光度。

d.測定標(biāo)準(zhǔn)溶液精密度。取0.5 mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液和0.5 mL蒸餾水置于10 mL具塞試管中混勻，加5%苯酚1.0 mL和濃硫酸5.0 mL，迅速振蕩混勻，室溫下放置30 min。取一定量的液體在最大吸收波長下測定吸光度。重復(fù)測定5次，求RSD值。

1.3 靈芝子實(shí)體多糖提取的單因素影響

①料水比對靈芝子實(shí)體多糖提取的影響 準(zhǔn)確稱取靈芝粉末1.0 g放入蒸餾瓶中，按設(shè)計的料液比1∶10，1∶20，1∶30，1∶40，1∶50加入蒸餾水。標(biāo)號后放入溫度80℃的水浴鍋中加熱回流1.5 h，過濾收集濾液，重新提取一次，合并2次濾液并將濾液濃縮，將濾液和濃度80%的乙醇溶液混合，4℃靜止過夜，3 000 r/min離心20 min，取沉淀按sevage法除蛋白，離心取上清液定容得靈芝粗多糖溶液，苯酚-硫酸法測定吸光度。

表1 正交試驗(yàn)因素和水平表L9（34）

表2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液精密度及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差

②提取溫度對靈芝子實(shí)體多糖提取的影響 準(zhǔn)確稱取靈芝粉末1.0 g放入蒸餾瓶中，按設(shè)計的60℃，70℃，80℃，90℃，100℃下提取。提取料液比為1∶30，加熱回流1.5 h，過濾收集濾液，重新提取一次，合并2次濾液并將濾液濃縮，將濾液和濃度80%的乙醇溶液混合，4℃靜止過夜，3 000 r/min離心20 min，取沉淀按sevage法除蛋白，離心取上清液定容得靈芝粗多糖溶液，苯酚-硫酸法測定吸光度。

③提取時間對靈芝子實(shí)體多糖提取的影響 準(zhǔn)確稱取靈芝粉末 1.0 g放入蒸餾瓶中，按設(shè)計的0.5 h，1 h，1.5 h，2 h，3 h分別提取。提取溫度80℃，加熱回流，過濾收集濾液，重新提取一次，合并2次濾液并將濾液濃縮，將濾液和濃度80%的乙醇溶液混合，4℃靜止過夜，3 000 r/min離心20 min，取沉淀按sevage法除蛋白，離心取上清液定容得靈芝粗多糖溶液，苯酚-硫酸法測定吸光度。

④醇析濃度對靈芝子實(shí)體多糖提取的影響 準(zhǔn)確稱取靈芝粉末1.0 g放入蒸餾瓶中，料水比1∶30，放入溫度80℃的水浴鍋中加熱回流1.5 h，過濾收集濾液，重新提取1次，合并2次濾液并將濾液濃縮，將濾液和按設(shè)計的醇析濃度70%，75%，80%，85%，90%乙醇溶液混合，4℃靜止過夜，3 000 r/min離心20 min，取沉淀按sevage法除蛋白，離心取上清液定容得靈芝粗多糖溶液，苯酚-硫酸法測定吸光度。

⑤正交試驗(yàn) 根據(jù)靈芝子實(shí)體多糖提取的單因素試驗(yàn)結(jié)果，以料水比、提取溫度、提取時間和醇析濃度為因素，設(shè)計了4因素3水平的L9（34）正交試驗(yàn)。其試驗(yàn)因素水平設(shè)計見表1，處理見表3。

2 結(jié)果與分析

2.1 最大吸收波長的確定

從圖1中可以看出，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液吸光度的變化趨勢是先上升后下降，其中在490 nm處有最大特征吸光度，說明采用苯酚-硫酸法測定葡萄糖含量最適的測定波長為490 nm。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖曲線的繪制

從圖2中可以看出，葡萄糖含量在0～0.08 mg間符合比爾定律，與吸光度有良好的線性關(guān)系，回歸方程是y=9.763 3x+0.044 1（R2為0.942 9，n=8）。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液精密度

從表2可以看出，所配標(biāo)準(zhǔn)溶液精密度的RSD為2.70%（n=5），說明試驗(yàn)的重復(fù)性很好。

2.4 單因素對靈芝子實(shí)體多糖提取的影響

①料水比對靈芝子實(shí)體多糖提取的影響 從圖3中可以看出，在其他提取條件不變的情況下，隨著料水比的增加，提取的靈芝粗多糖量也隨之增加，說明靈芝粗多糖能夠溶于水中，但在水中的溶解度并不是很大，需要不斷增加溶劑的量來達(dá)到溶質(zhì)的溶解。從圖3來看，這個平衡勢在料水比小的情況下很容易達(dá)到，所以說從柱形圖的增長趨勢來看，在料水比為1∶50時，從細(xì)胞內(nèi)部提取出來的多糖量仍有繼續(xù)增加的趨勢，即意味著可以通過增加更多的水溶劑（即降低料水比）得到更多的多糖，但同時也要注意太小的料水比也會增加后序濃縮的負(fù)擔(dān)。為了優(yōu)化靈芝子實(shí)體多糖提取工藝中料水比，可以選用1∶30，1∶40和1∶50作為下一步試驗(yàn)的因素水平。

圖1 波長與吸光度的關(guān)系

圖2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖3 料水比對子實(shí)體多糖提取的影響

圖4 提取溫度對子實(shí)體多糖提取的影響

②提取溫度對靈芝子實(shí)體多糖提取的影響 從溫度對靈芝子實(shí)體多糖提取影響的柱形圖中可以看出（圖4），在其他提取影響因素相同的條件下，在60～100℃范圍內(nèi)，靈芝子實(shí)體多糖的提取量隨著提取溫度的增加而增加。試驗(yàn)設(shè)計中如果溫度繼續(xù)升高，會使高溫條件下多糖的糖鏈斷裂，導(dǎo)致多糖提取量下降并影響到多糖的生物活性，另一方面，西藏地處世界的 “第三極”，平均海拔在4 000 m以上，空氣壓強(qiáng)隨海拔升高而降低，所以在西藏作為溶劑的水在90℃左右即可達(dá)到沸騰，試驗(yàn)中所采用的100℃溫度是在立式高壓菌鍋中實(shí)現(xiàn)的?？紤]到試驗(yàn)只是對西藏野生靈芝多糖的提取工藝進(jìn)行研究，所以試驗(yàn)中不需要耗用更多的能源。由此確定以后的試驗(yàn)中采用的溫度是70℃、80℃和90℃。

③提取時間對靈芝子實(shí)體多糖提取的影響 提取時間也是影響多糖提取的直接因素之一，從圖5中可以看出，當(dāng)提取時間在0.5～1.5 h變化時，多糖含量的變化非常大，提取時間增多，多糖得率快速增加，而提取時間在1.5～3 h變化時多糖含量有緩慢降低的趨勢，但這種降低從直線斜率來看并不是很明顯。說明開始時干燥子實(shí)體需要一段時間吸水軟化，故提取的多糖含量較??；軟化后，因?yàn)榘麅?nèi)溶液與提取液中粗多糖濃度差相差很大，擴(kuò)散進(jìn)行很快，單位時間內(nèi)多糖提取量較多；但隨著胞內(nèi)多糖濃度降低，擴(kuò)散速度減慢，多糖提取量也就減少，而且提取時間越長，細(xì)胞內(nèi)積溫越高，也會引起多糖結(jié)構(gòu)的破壞，不利于靈芝多糖的提取。同時考慮到為縮短工時，減少能耗和節(jié)約資金，暫以提取時間1 h，1.5 h，2 h作為下一步正交試驗(yàn)的時間選擇。

圖5 提取時間對子實(shí)體多糖提取的影響

圖6 醇析濃度對子實(shí)體多糖提取的影響

表3 L9（34）正交試驗(yàn)結(jié)果

表4 L9（34）正交試驗(yàn)的方差分析

④醇析濃度對靈芝子實(shí)體多糖提取的影響 由于多糖是極性大分子化合物，可溶于水而不溶于醇，不同濃度的乙醇可沉淀出不同組分的多糖，多糖的分子量越大，被沉淀下來所需要的乙醇濃度越小，乙醇濃度越大沉淀下來的多糖分子量越小，多糖含量越高。從圖6中可以看出，隨著酒精濃度增加靈芝多糖的提取量也在增加，特別是酒精濃度70%～80%時，在提取的靈芝多糖含量上有了很大的轉(zhuǎn)折，而在80%～90%之間靈芝多糖的含量變化并不是很大，多糖含量變化的趨勢線基本趨于直線，一方面說明濃度在80%以上的酒精對靈芝多糖的提取影響開始減弱，另一方面也說明80%～90%的醇析濃度基本上可以沉淀各種分子量的靈芝多糖。

⑤正交試驗(yàn)結(jié)果 試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用DPSv6.55數(shù)據(jù)處理軟件中的正交試驗(yàn)分析功能處理，分析結(jié)果如表3和表4。

據(jù)表3正交試驗(yàn)結(jié)果，極差R愈大的因素對指標(biāo)的影響愈顯著[6]，從極差值可以看出決定試驗(yàn)結(jié)果因素的主次關(guān)系為D＞B＞C＞A，從各水平的總提取率K來看，最優(yōu)組合為D3B3C3A3即試驗(yàn)條件：料水比為1∶50，提取溫度為90℃，提取時間為2 h，醇析濃度為90%。

以表3試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表4，由表中p值可見，影響靈芝多糖提取率的顯著因素是醇析濃度和提取溫度，與直觀分析的結(jié)果一致。但是最優(yōu)組合并未出現(xiàn)在正交表中，綜合考慮以上的分析結(jié)果，靈芝多糖的最優(yōu)提取工藝條件為：料水比1∶50，提取溫度90℃，提取2次，每次提取時間2 h，90%乙醇醇析，3 000 r/min離心30 min取沉淀，sevage法除游離蛋白，離心取上層液即為靈芝粗多糖溶液。

3 小結(jié)與討論

通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，西藏野生靈芝粗多糖的最優(yōu)提取工藝條件為：料水比1∶50，提取溫度90℃，提取2次，每次提取2 h，90%乙醇醇析，3 000 r/min離心30 min取沉淀，sevage法除游離蛋白，離心取上層液即為靈芝粗多糖溶液。通過苯酚-硫酸法測定西藏野生靈芝子實(shí)體粗多糖的含量約為0.734%。對比夏志蘭等[7]的研究發(fā)現(xiàn)，西藏野生靈芝子實(shí)體多糖含量處于中等水平，對于靈芝子實(shí)體多糖的提取有待進(jìn)一步的研究。而這一含量在全國靈芝品種中也處于中等水平，可以將野生靈芝加以人工馴化，改善野生靈芝的品質(zhì)以提高人工栽培靈芝的品質(zhì)，這樣的研究工作還有待于進(jìn)一步的加強(qiáng)。

[1]陳合，胡云紅，秦俊哲，等.靈芝菌原生質(zhì)體融合條件研究[J].食品科學(xué)，2007，28（2）：173-176.

[2]張志軍，李淑芳，劉建華.靈芝多糖提取-水浸提條件的研究[J].天津農(nóng)學(xué)院學(xué)報，2005，12（1）：12-15.

[3]陳瑜，梁運(yùn)祥，胡詠梅，等.固體發(fā)酵靈芝菌絲多糖的提取及組分分析[J].中國食用菌，2007，26（3）：34-37.

[4]王慧杰，李宇偉，連瑞麗，等.靈芝多糖液體發(fā)酵條件優(yōu)化[J].食用菌學(xué)報，2007，14（1）：37-42.

[5]寧慧青.不同食用菌多糖含量的比較研究[J].山西化工，2007，27（3）：44-46.

[6]洪偉，吳承禎.試驗(yàn)設(shè)計與分析原理·操作·案例[M].北京：中國林業(yè)出版社，2004：99-101.

[7]夏志蘭，周連玉，劉明月.靈芝深層發(fā)酵優(yōu)良菌株的篩選[J].菌物研究，2007，5（2）：75-80.

Study on Crude Polysaccharide Extraction Technology of Tibet Wild Ganoderma lucidum

YANG Xiaomei1,BAO Longyou1,GENG Xiangyong2,CAI Lingnan1
(1.School of Animal Science and Technology,Tibet Academy of Agriculture and Husbandry Animal Sciences,Linzhi, Tibet 860000;2.Reasearch Institute of Tibet Plateau Ecology)

The ganoderan is the main active ingredient of theGanoderma lucidum,which content has become an important indicator to measure its quality.Using water extraction and alcohol precipitation method extracts crude polysaccharide of the mythic fungus germ-entity,the optimal conditions analyzed orthogonal experiment method is followed below:ratio of material to water is 1∶50,the extraction temperature is 90℃,and extracting for twice per 2 h,90%alcohol analysis,centrifuging for 30 m at 3 000 rpm and take precipitation,using the way of sevage to remove floating preteins,centrifugation and taking the upper liquid which is theG.lucidumcrude polysaccharide liquid.It is using the way of Phenol-sulfuric acid method to measure the contents of the crude polysaccharide of the mythic fungus germ-entity which is 0.734%,and it is at upper middle level at polysaccharide of the mythic fungus germ-entity nationwide,it is also demanding further research and development and use.

Tibet;Wild;Ganoderma lucidum;Crude polysaccharide;Extraction

10.3865/j.issn.1001-3547.2010.22.013

西藏自治區(qū)科技計劃項目“西藏野生靈芝人工繁育技術(shù)研究”（2008AG15-02）

楊曉梅（1972-），女，講師，主要從事生物化學(xué)教學(xué)與科研工作，E-mail：xiaomeiy1972@163.com

鮑隆友（1953-），男，通信作者，教授，主要從事植物學(xué)的教學(xué)與科研工作，電話：13989940995

2010-07-22