徐希水 榮鳳梅

（①山東省煙臺市煙臺開發(fā)區(qū)農(nóng)業(yè)與海洋漁業(yè)局 264006 ②臨沂出入境檢驗檢疫局）

本試驗通過研究日糧添加不同水平的蛋氨酸對斷奶～2月齡、2～3月齡新西蘭肉兔肝臟中IGF-I基因表達的影響，初步探討日糧蛋氨酸與肝臟IGF-ImRNA表達量的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 動物組織材料

選取身體健康的新西蘭兔，在試驗一和試驗二屠宰結(jié)束充分放血后，立刻取肝臟相對固定部位樣品，放入Eppendorf管中，每管約0.5g，每組織至少6管重復(fù)，液氮速凍后，-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 組織總RNA的提?。?）前處理。凡與RNA操作有關(guān)的玻璃器皿和剪刀、鑷子等器械經(jīng)常規(guī)洗滌烘干后，用錫箔紙包好，180℃烘烤8h或200℃烘烤2～4h。塑料制品用0.1% DEPC浸泡處理37℃ 2h，或室溫處理過夜，再用滅菌雙蒸水漂洗數(shù)次，高壓消毒去除DEPC。注：操作過程中用到的所有試劑必須用DEPC處理過的水配制。（2）組織中總RNA的提取(Trizol法)。取50～100mg組織研磨成粉末(在液氮中操作)，轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管中。加入1ml Trizol，用力混勻至清澈，放置在冰上。4℃，12000g離心10min，將上清轉(zhuǎn)移至另一個1.5ml離心管中。加入0.2ml氯仿，用力搖動15s，室溫放置2～3min。4℃，12000g離心15min，將上清轉(zhuǎn)移至另一個1.5ml離心管中。加入0.5ml異丙醇，混勻，室溫放置30min沉淀RNA。4℃，12000g離心10min，棄上清。加入1ml 75%乙醇(DEPC水配制)洗滌RNA沉淀1次。4℃，7500g離心5min，棄乙醇。真空干燥，加入50～70μl DEPC·H2O溶解RNA，分裝0，-70℃保存。RNA含量的測定(比色法)：將提取的總RNA在紫外分光光度計260nm和280nm下測吸光度A值，并計算OD260/OD280的值。此值在1.7～2.0之間說明提取的RNA純度較高，適宜進行下一步的實驗(根據(jù)樣品在260 nm波長處的吸光度值確定總RNA提取液中RNA的濃度，以便在反轉(zhuǎn)錄的過程中進行定量：1個IU OD值(單鏈RNA)＝40g/ml；若低于1.7，則說明提取的RNA中可能蛋白質(zhì)的污染，可用酚：氯仿抽提去除)。

1.2.2 反轉(zhuǎn)錄 cDNA第一鏈的合成：加入RNA(2μg)和oligo(dt)(0.5μg)后，70℃5 min，迅速置于冰上冷卻，冰上加入5μl Buffer、5μl dNTP(10 mmol/L)、25U抑制劑(Takara)、200U M-MLV(Promega)，加0.1%DEPC處理水至總體積為25μl，混勻后稍離心，42℃ 1h，85℃15min，4℃結(jié)束，-20℃保存。

1.2.3 引物設(shè)計

表1 引物序列信息

1.2.4 PCR擴增（1）擴增體系：按照試劑說明書提供的比例，根據(jù)具體情況，擴增25 μl體系，具體如下：cNDA 1μl、 10×PCR Buffer 2.5μl、 MgCl2(25mM)2μl、dNTP(10mmol/L)2μl、上游引物(10mM)0.5μl、下游引物(10mM)0.5μl、R Taq酶0.2μl、加水至總體積為25μl(冰上操作)。（2）擴增程序：94℃預(yù)變性3min—94℃變性30s、57℃退火30s(30個循環(huán))—72℃延伸1min—72℃孵育5min、。

1.2.5 瓊脂糖電泳檢測 取10μl PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳，EB染色，用AlphaEaseFC凝膠圖像處理系統(tǒng)分析條帶灰度，結(jié)果用目的片段條帶凈灰度與GAPDH條帶凈灰度之間的比值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本試驗結(jié)果采用SAS(1985)GLM程序?qū)Ω黜棓?shù)據(jù)進行方差分析和相關(guān)分析，用Duncan氏法對各組間平均數(shù)進行多重比較。Excel繪圖工具進行繪圖。

2 結(jié)果與分析

（1）日糧中添加不同蛋氨酸水平對斷奶～2月齡新西蘭肉兔肝臟IGF-I mRNA基因表達量的影響日糧不同蛋氨酸添加水平對斷奶～2月齡新西蘭肉兔肝臟IGF-I mRNA基因表達量的影響見表2。由此可知，日糧添加不同水平蛋氨酸對IGF-I mRNA表達量影響顯著(P=0.045)，隨蛋氨酸添加量的升高，IGF-I mRNA的表達量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，當?shù)鞍彼岬奶砑恿繛?.4%時，IGF-I mRNA的表達量達到最高。（2）日糧中添加不同蛋氨酸水平對2～3月齡肉兔肝臟IGF-I mRNA基因表達量的影響蛋氨酸添加水平對2～3月齡新西蘭肉兔肝臟IGF-I基因表達量的影響見圖2。由圖2可知，日糧不同蛋氨酸水平極顯著影響肝臟IGFI mRNA基因表達量(P=0.001)，并且IGF-I基因表達量呈現(xiàn)升高后降低的趨勢，當?shù)鞍彼崽砑恿繛?.6%時，IGF-I的基因表達量最高，極顯著高于其他處理(P<0.01)。

表2 蛋氨酸添加水平對斷奶～2月齡新西蘭肉兔肝臟IGF-I mRNA基因表達量的影響(n＝6)

圖1 (a).持家基因GAPDH在斷奶～2月齡肉兔肝臟中的擴增圖譜1-15.GAPDH基因擴增產(chǎn)物, M:DNA Marker DL2000；(b).目的基因IGF-I在斷奶～2月齡肉兔肝臟中的擴增圖譜1-15.IGF-I基因擴增產(chǎn)物,M:DNA Marker DL2000.

圖2 蛋氨酸添加水平對2～3月齡新西蘭肉兔肝臟中IGF-I基因表達量的影響

圖3 (a).持家基因GAPDH在2～3月齡肉兔肝臟中的擴增圖譜.1-15.GAPDH基因擴增產(chǎn)物, M:DNA Marker DL2000；(b).目的基因IGF-I在2～3月齡肉兔肝臟中的擴增圖譜1-15.IGF-I基因擴增產(chǎn)物, M:DNA Marker DL2000.

3 討論

本試驗中，日糧不同蛋氨酸水平對斷奶～2月齡肉兔肝臟IGF-I mRNA的表達量影響顯著，對2～3月齡肉兔肝臟IGF-I mRNA的表達量影響極顯著。說明蛋氨酸影響肝臟IGF-I mRNA的表達量的同時，也影響血清IGF-I的含量，這可能是蛋氨酸能提高肝臟IGF-I mRNA的表達量，當IGF-I mRNA的表達量豐富時，血液中產(chǎn)生的IGF-I也會隨之增多。本試驗條件下，蛋氨酸的添加量為0.4%時，斷奶～2月齡肉兔肝臟IGF-I mRNA表達量最高，此時血清IGF-I的含量也最高；當?shù)鞍彼岬奶砑恿繛?.6%時，2～3月齡肉兔肝臟IGF-I mRNA表達量最高，血清IGF-I濃度也最高。因此，肉兔不同生長階段IGF-I mRNA表達量對日糧蛋氨酸不同含量的反映不一樣。

試驗表明，胰島素在調(diào)節(jié)采食量上起著重要的作用，因為它能促進肝臟中IGF-I基因的表達(Houston等，1991；Boni-Schnetzler等，1991)。本研究表明，血清IGFI的含量與動物的生長性能有著密切的關(guān)系，這也提示了當IGF-I mRNA的表達量升高時，也會提高生長肉兔的生長性能。在家禽中，IGF-I mRNA的表達受到生長激素依賴型和非依賴型方式的調(diào)節(jié)(Yun等，2005)。肝臟可能是產(chǎn)生循環(huán)IGF-I 最主要的器官，因為它具有非常豐富IGFI 信使mRNA(Murphy等，1987)，并且，IGF-I mRNA合成IGF-I解釋了已知的循環(huán)IGF-I 的轉(zhuǎn)化(Schwander等，1983)。肝臟中總IGF-I基因的表達受GH(Roberts等，1986；Norstedt和Muller，1987)和日糧中能量(Emler等，1987；Strauss等，1991；Goldstein等，1991)、蛋白(Ketelslegers等，1991)的調(diào)節(jié)。胰島素在調(diào)節(jié)采食量上起著重要作用，因為它能促進肝臟IGF-I基因的表達(Houston等，1991；Boni-Schnetzler等，1991)。所以，對于2～3月齡肉兔，肝臟IGF-I mRNA表達量最高時，蛋氨酸水平為0.6%，與其達到最大生產(chǎn)性能時蛋氨酸的添加量不同，其原因可能是IGF-I的表達及血清中的含量也同時受到Ins、GH、日糧中能量、蛋白水平的影響。

同時，2～3月齡肉兔肝臟IGF-I mRNA的表達量要低于斷奶～2月齡的表達量，這可能是因為本研究中斷奶～2月齡的肉兔生長速度要快于2～3月齡的肉兔的緣故。

4 小結(jié)

日糧不同蛋氨酸水平顯著或極顯著影響斷奶～2月齡和2～3月齡肉兔肝臟IGF-I mRNA的表達量，生長肉兔的不同階段表達量不同，肝臟IGF-I mRNA的表達量與血清IGF-I濃度同步。

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